3個花鰻鱺地理種群的AFLP分析

朱友芳, 林鳳欽, 王藝磊, 謝芳靖

(1. 福建省莆田市水產科學研究所, 福建 莆田 351100; 2. 集美大學 水產學院 福建省高校水產科學技術與食品安全重點實驗室, 福建 廈門 361021)

3個花鰻鱺地理種群的AFLP分析

朱友芳1, 林鳳欽2, 王藝磊2, 謝芳靖2

(1. 福建省莆田市水產科學研究所, 福建 莆田 351100; 2. 集美大學 水產學院 福建省高校水產科學技術與食品安全重點實驗室, 福建 廈門 361021)

應用AFLP分子標記技術首次對澳大利亞、海南島和菲律賓3個種群的共60尾花鰻鱺(Anguilla marmorata)幼魚樣品進行了遺傳多樣性分析。4對選擇性擴增引物共擴增得到180個位點, 平均每對引物擴增出45個位點。澳大利亞、海南島和菲律賓3個種群的多態位點分別為78.33%、79.44%和84.44%,Nei′s遺傳多樣性指數分別為 0.330 2±0.188 9、0.337 2±0.194 6 和 0.357 1±0.176 7, Shannon′s多樣性指數分別為0.477 3±0.264 7、0.484 4±0.270 2和0.514 6±0.243 3; 根據基因分化系數和AMOVA分析估算,3個花鰻鱺種群遺傳變異分別有89.25%和96.07%存在于種群內, 10.75%和3.93%存在于種群間。基因分化系數、AMOVA分析、遺傳距離、基因流、系統樹和顯性基因型頻率分析結果表明： 3個花鰻鱺種群間出現了遺傳分化, 地理距離越大遺傳分化程度越高, 三者之間出現一定的基因交流。研究結果對花鰻鱺養殖具有指導意義。

花鰻鱺(Anguilla marmorata); 種群; AFLP; 遺傳變異

花鰻鱺(Anguilla marmorata)隸屬鰻鱺目(Anguilliforme)、鰻鱺科(Anguillidae)、鰻鱺屬(Anguilla), 屬熱帶和亞熱帶江海洄游魚類, 分布范圍廣, 東達太平洋中部諸島, 西達非洲東部, 南達澳大利亞南部, 北達朝鮮、日本南部, 中國產于長江以南至海南島各江河水域[1-2]。

有關不同種群花鰻鱺的骨骼結構差異及遺傳多樣性已有研究報道, Watanabe等[3]通過對花鰻鱺脊椎骨的數目研究, 得出了密克羅西尼亞島(Micronesia)的花鰻鱺脊椎骨的數目與印度洋及太平洋其他12個花鰻鱺種群存在明顯差異的結論; Minegishi等[4]采用線粒體DNA和微衛星分析的方法, 得出了可以將花鰻鱺劃分為南太平洋、北太平洋、東印度洋和西印度洋4個種群的結論; Gong等[5]采用微衛星分析的方法, 得出了花鰻鱺的 Aus(澳大利亞)種群和中國種群的多樣性指數相似、所有位點均符合哈迪-溫伯格平衡的結論; 齊興柱等[6]通過對線粒體細胞色素b基因的測序, 得出了花鰻鱺的日本和夏威夷種群的地理差異小于Hai(中國海南島)種群與它們之間的地理差異的結論。

擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism,簡稱 AFLP)具有多態性強, 譜帶豐富且清晰可辨, 實驗結果穩定性、重復性好的特點, 可以在一次實驗中同時觀察到大量的限制性片段。因此, AFLP技術廣泛應用于種質鑒定、基因克隆和定位、遺傳圖譜構建和遺傳差異分析等研究[7-12]。目前中國花鰻鱺養殖的苗種主要來源于澳大利亞、海南島和菲律賓三地,三者在水溫、馴食和抗病力等方面均存在差異。為了分析產生這些差異的原因, 本研究首次采用 AFLP技術對花鰻鱺的 Aus種群、Hai種群和 Phi(菲律賓)種群進行遺傳多樣性分析, 研究結果對花鰻鱺養殖具有一定的指導意義。

1 材料和方法

1.1 實驗魚

收集 Aus墨爾本附近海域、Hai東海岸和 Phi棉蘭老島東部的花鰻鱺幼魚各 20尾, 取肌肉固定于95%的酒精中, 4℃保存備用。

1.2 基因組DNA提取

DNA提取和純化參照 Sambrook等[13], 采用苯酚/氯仿法提取總DNA。DU640紫外分光光度儀測定DNA濃度, 用無菌雙蒸水將模板的一部分稀釋到20 mg/L, 置于4℃中保存, 其余的未稀釋的模板母液放于-20℃冰箱中備用, 通過 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性以及純度, 凝膠電泳采用GDST500紫外凝膠成像分析系統。

1.3 AFLP指紋圖譜構建

參照 Vos等[14]和 Wang等[15]方法構建 AFLP指紋圖譜。AFLP接頭和預擴增引物序列見表1。2種內切酶分別為EcoR I和Mse I。經過預實驗從8種EcoR I引物(E-AA、E-AC、E-AG、E-AT、E-TA、E-TC、E-TG和 E-TT)和 8種 Mse I引物(M-CAA、M-CAC、M-CAG、M-CAT、M-CTA、M-CTC、M-CTG和 M-CTT)共 64對引物組合中, 篩選出 4對選擇性擴增引物組合(4對引物組合分別為： E- TG/M-CAC,E-TG/M-CAT, E-AA/M-CAC, E-AA/M-CAA)進行AFLP分析。AFLP試劑盒購自invitrogen公司。

表1 AFLP接頭及預擴增引物序列Tab. 1 Adaptors and pre-amplification primer sequences in AFLP analysis

1.3.1 酶切反應

每個樣品的酶切混合液包括： 160 ng的 DNA樣品, 0.2 μL的Mse I(Mse I 10 mol/L), 4 μL的10×Tango反應緩沖液, 再加雙蒸水至反應總體積18 μL。將反應混合液置于 MJ-PTC200溫度梯度 PCR儀中進行Mse I酶切, Mse I酶切反應條件： 65℃ 3 h, 80℃ 15 min, 4℃ 5 min。反應結束后, 再加入0.2 μL的 EcoR I(EcoR I 10 mol/L), 加雙蒸水至總反應體積20 μL,進行EcoR I酶切, EcoR I酶切反應條件： 37℃ 3 h,80℃ 15 min, 4℃ 5 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果, 4℃下保存備用。

1.3.2 連接反應

每個連接反應混合液包括： 酶切樣品10 μL, 10 nmol/L EcoR I/Mse I接頭 0.8 μL, 10×T4反應緩沖液2 μL, 1 mol/L T4連接酶 0.5 μL, 加雙蒸水至總體積20 μL, 22℃恒溫過夜。-20℃下保存備用。

1.3.3 預擴增反應

反應混合液包括： 2 μL 的連接產物, 2 μL的10×Taq buffer, 1.6 μL 的 25 nmol/L MgCl2, 0.5 μL 的dNTPs(10 mmol/L), 0.17 μL 的 E0(33 mol/L), 0.17 μL的M0(33 mol/L), 13.46 μL的無菌雙蒸水, 0.1 μL的Taq DNA 聚合酶(5 U /μL), 共 20 μL。PCR 反應條件：先 94℃ 1 min; 再 94℃ 30 s, 56℃ 60 s, 72℃ 60 s,共20個循環; 4℃ 5 min。預擴增完成后, 將產物在1%瓊脂糖凝膠中檢測預擴增產物的效果。將預擴增產物取出5 μL加入45 μL雙蒸水, 混合均勻作為選擇性擴增模板。

1.3.4 選擇性擴增反應

取5.0 μL的選擇性擴增模板, 各加入15.0 μL選擇性擴增反應混合液： 2.0 μL的10×Taq buffer, 1.2 μL的 25 nmol/L MgCl2, 0.4 μL 的 dNTPs(10 mmol/L),10.2 μL的無菌雙蒸水, 0.5 μL的 EcoR I引物(10μmoL/L), 0.5 μL 的 Mse I引物(10 μmoL/L)。0.2 μL的Taq DNA聚合酶(5 U /μL)。PCR反應條件： 首先94℃ 1 min; 再 94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 60 s, 循環 13次(每一循環退火溫度減少 0.7℃), 然后 94℃30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 60 s, 23 個循環; 72℃ 10 min;4℃ 5 min。最后4℃保存。

1.3.5 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

AFLP擴增產物(共 20 μL)在電泳前加入 10 μL上樣緩沖液, 95℃變性5 min, 立即放入冰盒中冷卻(防止復性)。采用 6%的變性聚丙烯酰胺凝膠, 電泳緩沖液為 1×TBE, 在恒電壓 2 000 V 下使用美國Bio-Rad聚丙烯酰胺凝膠電泳儀電泳, 先預電泳30～45 min, 直至溫度達到 55℃。然后每個樣品取5 μL上樣, 恒電壓2000V電泳2 h左右, 用銀染法顯示電泳結果。

1.4 數據統計分析

對所有擴增清晰的條帶進行記錄, 采用“0-1”系統記錄譜帶位置, 觀察擴增條帶的有無, 有帶記為“1”, 無帶記為“0”。將上述獲得的 AFLP指紋圖譜轉換成 1和 0構成的數字矩陣, 結果填入Microsoft Excel 表格中。在種群處于Hardy-Weinberg平衡的條件下, 利用POPGENE VERSION 1.31[16]軟件統計位點總數、多態位點數, 計算多態位點頻率、顯性基因型頻率、Nei′s基因多樣性指數、Shannon′s多樣性指數、種群總基因多樣性、種群內基因多樣性、種群間的Gst(基因分化系數)、種群間的Nm(基因流系數)、遺傳相似度和遺傳距離等。利用 Arlequin 3.5進行 AMOVA分析, 采用 MEGA 3軟件以UPGMA法對3個種群進行聚類分析, 構建群體間親緣演化系統樹圖譜。

2 結果

2.1 3個種群AFLP擴增結果及遺傳多樣性

用 4對選擇性引物(即引物組合 E-TG/M-CAC,E-TG/M-CAT, E-AA/M-CAC, E-AA/M-CAA)對花鰻鱺3個種群共60個樣本的DNA進行AFLP分析, 共擴增出180條清晰的條帶, 其中多態性條帶為160條,Aus、Hai和Phi 3個種群的多態位點分別為78.33%、79.44%和84.44%, 總多態位點比率為88.89%(表2)。將每個擴增片段視為一個基因位點, 每對引物檢出的位點數從34～50個不等, 平均每對引物檢出45個位點。在3個種群中, Phi種群的遺傳多樣性最高, 而Aus種群的遺傳多樣性最低。

表2 3個種群擴增結果及遺傳學參數Tab. 2 Amplification results and parameters of genetic diversity in the three Anguilla marmorata populations

2.2 3個種群的遺傳分化及聚類分析

根據Gst(表3)和AMOVA分析估算(表4), 3個花鰻鱺種群遺傳變異分別有89.25%和96.07%存在于種群內, 10.75%和3.93%存在于種群間。

根據 Wright[17]的標準,Gst值介于 0～0.05, 表明種群間遺傳分化較弱; 介于 0.05～0.15, 表明種群間遺傳分化中等; 0.15～0.25表明種群間遺傳分化較大;當Gst值＞0.25表明分化極大。由表3得出Aus種群～Hai種群、Aus種群～Phi種群和 Hai種群～Phi種群均出現中等遺傳分化。

地理距離： Aus～Hai＞Aus～Phi＞Hai～Phi;Gst(表3)： Aus種群～Hai種群＞Aus種群～Phi種群＞Hai種群～Phi種群; 遺傳距離(表 5)： Aus 種群～Hai種群＞Aus種群～Phi種群＞Hai種群～Phi種群, 可見地理距離越大遺傳分化程度越高。

通常認為種群間的Nm＜1, 種群間基因交流是有限的, 若Nm＞1, 說明種群間通過某種渠道進行基因交流[18]。花鰻鱺兩兩種群間的Nm和 3個種群的總Nm均超過1, 說明種群間有基因交流。3個花鰻鱺種群間的Nm以Hai種群～Phi種群最高。

將 180個擴增位點的顯性基因型頻率以 10%為單位劃分區間, 0和1分別設為一個單獨的區間, 統計顯性基因型頻率位于各區間內的位點數。通過對不同種群的顯性基因型頻率在各區間內的位點數的走勢比較, 可以分析出各種群遺傳結構是否存在差異。由圖1可以看出3個種群的曲線走勢呈現出規律性, 總體趨勢基本相似, 但有差異： Aus種群與Phi種群在0～9%和40%～69%區間走勢不同; Aus種群與Hai種群在 0～9%和 50%～69%區間走勢不同; Hai種群和Phi種群在40%～59%區間走勢不同。說明3個種群在遺傳結構方面存在一定的差異。通過計算花鰻鱺3個不同地理種群之間的Nei′s遺傳相似度和遺傳距離(表5), 根據遺傳距離構建系統樹(圖2), 由圖2中看出Hai種群和Phi種群親緣關系較近, 首先聚在一起, 它們與Aus種群親緣關系較遠, 最后聚在一起。

表3 3個花鰻鱺種群遺傳分化Tab. 3 Genetic differentiation for the three populations of Anguilla marmorata

表4 花鰻鱺種群的AMOVA分析數據Tab. 4 Data derived from AMOVA of Anguilla marmorata

表5 種群間遺傳相似度(對角線*上)及遺傳距離(對角線*下)Tab. 5 Inter-population genetic identity (above diagonal)and genetic distance (below diagonal)

圖1 擴增位點數在不同顯性基因頻率區間內分布Fig. 1 Distributions of amplified loci in different frequency intervals

圖2 UPGMA方法構建3個花鰻鱺種群的系統樹Fig. 2 UPGMA dendrogram by AFLP in the three Anguilla marmorata populations

3 討論

Aus種群和Hai種群的Nei’s遺傳多樣性指數分別為 0.330 2±0.188 9 和 0.337 2±0.194 6、Shannon′s多樣性指數分別為0.477 3±0.264 7和0.484 4±0.270 2,Aus和Hai兩種群多樣性指數相似, 這與采用微衛星分析的方法得出的花鰻鱺 Aus種群和中國種群多樣性指數相似的結論一致[5]。

有關研究人員采用 AFLP技術對日本鰻鱺(Anguilla japonica)[9]、藍圓鲹(Decapterus maruadsi)[10]和魚(Miichthys miiuy)[11]進行遺傳多樣性分析, 得出了這三種魚的多態位點比例分別為62.81%～74.10%、64.65%和68.86%～72.51%, 并根據多態位點比例認為日本鰻鱺、藍圓鲹和魚遺傳多樣性較高。3個花鰻鱺種群多態位點比例為 78.33%～84.44%, 高于日本鰻鱺、藍圓鲹和魚, 可見3個花鰻鱺種群遺傳多樣性目前還處在較高的水平。我們認為與花鰻鱺自然產卵、產卵后親魚死亡、自然種群分布廣、人為干擾因素較少等相關。

Minegishi等[4]采用線粒體DNA和微衛星分析的方法, 將花鰻鱺劃分為南太平洋、北太平洋、東印度洋和西印度洋4個種群, 據此分析, 屬于南太平洋的Aus種群與屬于北太平洋的Hai種群和Phi種群出現了遺傳分化, 這與本次研究所得的結論一致。齊興柱等[6]在利用細胞色素 b基因對不同地域花鰻鱺種群進行分析時得出了同位于北太平洋花鰻鱺的日本種群和 Hai種群兩者之間存在地理差異, 本次研究同樣也得出了同位于北太平洋Hai種群和Phi種群間出現了遺傳分化的結論。

研究結果表明, 3個花鰻鱺種群間出現了中等程度的遺傳分化, 我們認為原因可能為： 花鰻鱺于成年時降河洄游到江河口附近性腺才開始發育, 而后入深海進行繁殖。初孵出仔魚為白色薄軟的葉狀體,葉狀體尚不能自主游動, 依靠海流將其帶到陸地沿岸后發生變態, 變成短的圓線條狀的幼鰻, 進入淡水河湖內索食生長。由于 3個花鰻鱺種群性腺成熟的時間及到達產卵場的時間不同, 不同種群親魚所產的仔魚在不同的海流的作用下, 于特定的時間到達特定的地域, 因此3個種群難以融合在一起形成1個隨機交配的大種群, 3個種群間出現中等程度的遺傳分化。

花鰻鱺兩兩種群間的Nm和3個種群的總Nm均超過 1, 種群間有基因交流, 遺傳分化與地理距離成正相關, 原因可能是： 雖然不同種群花鰻鱺的親魚因產卵時間的差異而無法交配, 但花鰻鱺魚卵和仔魚隨海流漂浮和遷移, 不同年份海流的變化可能使少數花鰻鱺的魚卵和仔魚的漂浮和遷移路線發生變化, 混合到其他種群中, 種群內魚卵和仔魚的遷入遷出減弱了種群間的遺傳分化, 產生了一定的基因交流, 地理距離越遠, 攜帶不同種群花鰻鱺魚卵和仔魚的海流混合的機會越少, 因此遺傳分化與地理距離成正相關。

中國花鰻鱺養殖苗種主要來源于Aus、Hai和Phi三地, 三者在水溫、馴食和抗病力方面均表現出差異,如與Hai和Phi的苗種相比, Aus的苗種可適應較低的水溫, 在精養池中比較容易馴食, 但容易發生單鰓病等病害, 而 Hai的苗種則為三者中最難馴食的,由水絲蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)轉為配合飼料往往無法轉換成功, 究其原因可能與 3個種群間的遺傳分化有關。因此, 在今后的養殖生產中必須加強花鰻鱺的基礎生物學研究, 對不同產地的花鰻鱺采用不同的養殖模式、馴食方式和誘食劑等, 以滿足各自生長的需要, 達到高產穩產的目的。

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AFLP analysis of threeAnguilla marmoratageographic populations

ZHU You-fang1, LIN Feng-qin2, WANG Yi-lei2, XIE Fang-jing2
(1. Putian Municipal Institute of Fishery Science, Putian 351100, China; 2. The Key Laboratory of Science and Technology for Aquaculture and Food Safety, Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China)

Dec., 08, 2010

Anguilla marmorata; population; AFLP; genetic variation

This study is the first of its kind to document genetic diversity of giant mottled eel (Anguilla marmorata) among three geographic populations of Australia, Hainan Island, and Philippines. This study was performed on 60 young eels by using AFLP molecular marker technique. A total of 180 AFLP loci, of which 160 loci were polymorphic, were detected by four primer combinations. The percentage of polymorphic loci from Australia, Hainan Island, and Philippines was 78.33%, 79.44%, and 84.44%, respectively; Shannon's diversity index was 0.477 3±0.264 7, 0.484 4±0.270 2, and 0.514 6±0.243 3, respectively. TheGstand AMOVA analysis showed that there were 89.25% and 96.07% genetic variation within the three populations, and 10.75% and 3.93% genetic variation among populations. Our results indicate that genetic differentiation has occurred and has a positive correlation with geographic distant. Meanwhile, gene flows exist among all three populations. These data will be important for the farming management ofA. marmorata.

Q347

A

1000-3096(2011)08-0083-06

2010-12-08;

2011-06-13

福建省高校水產科學技術與食品安全重點實驗室基金資助項目(2008J201)

朱友芳(1964-), 男, 福建仙游人, 副研究員, 碩士研究生,主要從事水產養殖及病害防治的研究, 電話： 0594-6298821, E-mail：e365cn@163.com

譚雪靜)