生物傳感技術在海洋監測中的應用

(中國科學院 煙臺海岸帶可持續發展研究所 山東 煙臺,264003)

21世紀是海洋開發的世紀,我國將更加關注在可持續發展前提下的海洋資源的合理開發和海洋環境保護,特別是更多地關注近海生態環境的監測和保護。用于海洋監測的生物傳感器技術是一種基于生物敏感元件對污染物的生理、生化、細胞反應而建立起來的海洋生物監測技術,有很高的靈敏度,并可與生物個體的生長、繁殖、代謝、存活等指標直接聯系起來,從而有可能就污染對生物種群、群落乃至整個生態系統的影響做出評價和預測[1]。監測水質新型赤潮預警系統——冷光藻青菌生物傳感器的研制成功,突出顯示了生物傳感器應用于海洋監測的優點。迄今為止,人們已經開發了很多用于環境監測的傳感器(生物傳感器和其他類型傳感器),生物傳感器具有特異性好、靈敏度高、分析速度快、能在復雜體系中在線連續監測等特點,被廣泛用于生命科學、醫學檢驗、食品安全及環境監測等多個領域。其中,在環境檢測中的應用尤為令人矚目。人們已經開始研究用于海洋監測的生物傳感器,本文將對生物傳感器在海洋監測領域的應用做一總結。

1 生物傳感器定義及分類[2]

生物傳感器是一門集微電子學、材料科學、生物技術等學科為一體的高新技術。它是由分子識別元件(感受器)和與之結合的信號轉換器(換能器)兩部分組成的分析工具或系統。前者可以是生物體成分(酶、抗原、抗體、激素、DNA)或生物體本身(細胞、細胞器、組織),它們能特異地識別各種被測物質并與之反應;后者主要有電化學電極、離子敏感場效應晶體管、熱敏電阻器、光電管、光纖、壓電晶體等,其功能為將敏感元件感知的生物化學信號轉變為可測量的電信號。生物傳感器按所用分子識別元件的不同,可分為酶傳感器、微生物傳感器、組織傳感器、細胞傳感器、免疫傳感器等;按信號轉換元件的不同,可分為電化學生物傳感器、半導體生物傳感器、測熱型生物傳感器、測光型生物傳感器、測聲型生物傳感器等;按對輸出電信號的不同測量方式,又可分為電位型生物傳感器、電流型生物傳感器和伏安型生物傳感器。本文按檢測對象的不同對生物傳感器(技術)在海洋監測中的應用進行簡要總結。

2 應用于海洋領域的生物傳感技術研究進展

2.1 營養鹽的檢測

氮、磷、硅等植物營養物質含量過多所引起的水質污染現象——富營養化,能夠加速水生生物特別是藻類的大量繁殖,使生物種群結構發生變化,生物多樣性破壞,從而導致水體生態平衡遭到破壞。這些營養物質包括硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、磷酸鹽、硅酸鹽等,及時監控這些營養鹽的含量對于預警赤潮等是非常必要的。已有多篇酶[3-7]和微生物[8-10]傳感器用于檢測硝酸鹽和亞硝酸鹽的報道。檢測硝酸鹽和亞硝酸鹽的酶傳感器主要使用硝酸鹽和亞硝酸鹽的還原酶,這些酶傳感器的使用主要受限于酶的可利用度以及酶的成本[11],硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶已經可以從很多生物源中分離出來[12-14],利用溶膠-凝膠固定酶可以避免酶活性的損失[14]。Larsen等[15]在傳感器中固定反硝化細菌(不含一氧化二氮還原酶),反硝化細菌將硝酸鹽還原為一氧化二氮,使用電化學檢測一氧化二氮,鑒于該傳感器在淡水和海水中對亞硝酸鹽和硝酸鹽均有良好的響應,因此,已經實現商品化(http：//www.unisense.com)。用于檢測銨鹽的生物傳感器并不多,比較常見的是檢測銨鹽的離子選擇性電極和化學傳感器,但是,由于海水中高濃度的干擾離子使這些傳感器不能直接應用于海水的檢測。目前文獻中還未見有關硅酸鹽離子傳感器的報道。Amine 等[16]綜述了有關檢測磷酸鹽、硝酸鹽等的生物傳感器,檢測磷酸鹽的生物傳感器主要是基于各種磷酸酯酶的生物傳感器。盡管已有諸多的傳感器用于檢測磷酸鹽,據我們所知,至今沒有一臺傳感器能夠用于海水中磷酸鹽的檢測(因海水中多種離子的存在,會對磷酸鹽的檢測造成干擾)。開發能夠用于海水中磷酸鹽檢測的生物傳感器將會填補該領域的一項空白。

2.2 生物物種檢測

分子生物學以及相關生物傳感器的迅速發展,拓展了它們在環境微生物多相分類中的應用。尤其在識別幼小的物種或者形態不明顯的菌株等方面發揮了重要作用。同時它們在生物物種資源的分子系統和進化的研究、新的生物物種資源的發現和開發利用,如特殊生態環境中新的未知生物類群的發現、分類鑒定及應用等方面也開始大顯身手。

Lee[17]等報道了基于化學發光的生物傳感器用于檢測赤潮生物海洋褐胞藻(Chattonella marina)。2-甲基-6-(p-甲氧苯基)-3,7-二氫咪唑并[1,2-α]吡嗪-3-酮在超氧陰離子存在的情況下可以作為化學發光探針,褐胞藻能夠釋放超氧陰離子,通過檢測超氧陰離子來間接測定褐胞藻的濃度。他們還用該傳感器測定了赤潮異彎藻 (Heterosigma akashiwo),骨條藻(Skeletonema costatum),角毛藻(Chaetoceros sociale),紫球藻(Porphyridium cruentrum)和褐胞藻(Chattonella antique)。其結果是該傳感器只對褐胞藻類有特征響應,對其他藻類沒有響應。目前,人們研發了很多基于核酸雜交技術的生物傳感器、DNA芯片和陣列,利用雜交探針來識別物種的特異序列。已有多篇綜述[18-22]概括了這些傳感器、芯片和陣列的研究進展。Monterey 海灣水產研究所一直致力于研究“環境樣品處理器”,現在該儀器第二代已經研究成功并投入使用(http：//www.mbari.org/ESP)(圖1和圖2),該儀器的核心技術就是利用DNA探針陣列實時原位的檢測微生物及其基因產物,其中最常用的技術就是夾心雜交測定和酶聯免疫測定。研究該儀器主要目的是利用基因技術識別海洋微生物,以此進一步研究它們在生物地球化學循環中的作用。目前,該儀器可以原位收集和分析海洋下層水樣,使用分子探針自動識別微生物和它的基因產物。另外,該儀器已經實現遠程控制,可以實時、在線、長期在海水中進行作業。該儀器的研制成功,不但節約了收集樣品的時間,也大大降低了人們在海洋生物方面研究的成本,為海洋生物分類識別的研究提供了更有利的技術支撐。

圖1 環境樣品處理(http：//www.mbari.org/ESP)

圖2 第二代環境樣品處理器核心部件(http：//www.mbari.org/ESP)

2.3 污染物的檢測

海洋污染物主要指經由人類活動直接或間接進入海洋環境,并能產生有害影響的物質或能量。海洋中的污染物種類多,數量大,且危害深遠。因此,需要嚴格控制這些污染物的排放,這些污染物主要包括石油及其產品,農藥,防污物料,重金屬離子,毒素等。

2.3.1 有機農藥

Kr?ger等[23]描述了生物傳感器在海洋監測要素如營養鹽、抗生物污染試劑、殺蟲劑、激素干擾劑以及分子生物分類系統中的應用。分析和預測了將來用于海洋監測的傳感體系所需要的條件以及可能面臨的挑戰。最近, Hildebrandt等[24]制作了一種便攜式傳感器,該傳感器可以檢測海水以及食品中的氯吡硫磷(有機磷的一種)和氨基甲酸酯。他們將乙酰膽堿酯酶固定于絲網印刷電極上,這樣使得成本較低,利于大批量生產和一次性使用。Zhang等[25]利用層層自組裝技術修飾的多壁碳納米管和乙酰膽堿酯酶傳感器檢測了海水中的蟲螨威(氨基甲酸酯的一種),其檢測限可達到10-11g/L。用于檢測殺蟲劑的生物傳感器大部分是基于乙酰膽堿酯酶的抑制傳感器[26-27],其主要原因是乙酰膽堿酯酶的成本較低。另外,還有一些免疫傳感器也可用于殺蟲劑的檢測,如 Penalva等[28]制作的檢測包含 Irgarol的殺蟲劑的免疫傳感器,可用于有機提取物和海水樣品檢測。Mallat等[29-30]研發了用于檢測河口水樣品中的百草枯和異丙隆的生物傳感器,檢測限可達到0.1 μg/L。一些細胞傳感器[31-32]可用于莠去津、西瑪津、異丙隆、敵草隆等的檢測,其檢測限可達1 μg/L。利用細胞傳感器檢測這些物質不但比較靈敏,而且能夠得到有關生物利用度和生理反應的一些信息,缺點是這些傳感器不像酶傳感器,只對一種物質有特異性響應,通常被一些重金屬所干擾,所以也有不利的一方面。

2.3.2 含油污水

海洋監控的另一個主要方向是污染海洋環境的油氣田采出水(也叫油氣田含油污水)和油井的鉆井液。通常,采出水的成分非常復雜,其中包含防沫劑、生物殺滅劑、阻蝕劑和破乳劑等,這些物質均能產生一系列急性的或者慢性的毒性效應。對于這樣一個復雜的體系,若使用相關的化學或者物理技術來監測,雖然比較靈敏和準確,專一性也較好,但是它們不能提供這些污染物的生物相容性數據和污染物對生物體系的影響以及對環境產生的毒性效應。而生物傳感體系非常適用于微生物的一般毒性測試,從而可以得到一系列與生物體系和環境相關的數據。如LaGier等[33]報道的電化學生物傳感器用于檢測微生物污染物以及毒藻和 S?rensen等報道細胞傳感器用于毒性的測試等[34]。

2.3.3 防污物料

另一個廣泛污染海水水體和沉積物的污染物是防污物料——有機錫化合物如三丁基錫(TBT)。有報道稱ng/L級濃度的有機錫即會對水中生物產生毒害作用[35],因此這些化合物已被國際海事組織禁止使用。有機錫致毒濃度很低,但是目前所研究的生物傳感器對有機錫的最低檢測限還不能檢測到致毒的最低濃度,仍有待于進一步的開發研究。Durand等[36]報道的基于細菌生物發光技術的生物傳感器對 TBT的檢測限為26 μg/L,對DBT(二丁基錫)的檢測限為0.03 μg/L。Thouand等在第8次世界生物傳感器大會上報道的在流動體系內將細菌固定于芯片上,采用發光檢測的生物傳感器對 TBT的檢測限可達到325 ng/L。這已經是報道的最低檢測限,由此看來,用于檢測有機錫的生物傳感器技術仍需進一步提升。

2.3.4 重金屬污染物

海洋環境中的痕量金屬具有雙重作用：在海洋的某些區域,它們是促進藻類生長的必需物質,而在其他的一些環境中又可以造成污染。文獻中報道了很多生物傳感器可用于金屬離子的檢測,例如,Zeng等[37-38]報道的使用基于熒光的光纖生物傳感器實時檢測海水中游離的 Cu2+濃度,檢測限可以達到0.1 pmol/ L。但是此傳感器測量幾個小時后,由于生物污染以及Zn或者Hg的干擾而不穩定;Cathy等[39]制作的 Parabactin生物傳感器對 Fe(III)的檢測限為1 nmol/L;使用algae C.vulgaris細胞制作的傳感器用來檢測鎘離子[40];酶傳感器檢測鋅離子[41];DNA傳感器檢測鉛離子[42]。在海洋化學中,痕量金屬的形態與分析是一個很廣闊的領域,鑒于海水中存在多種元素,痕量金屬的分析常常受到基體效應和其他共存離子的干擾,因此研究選擇性好的檢測限低的生物傳感器是未來的發展方向。

2.3.5 生物毒素

隨著水產養殖業的迅速發展和有害赤潮的頻繁爆發,藻類和貝類的生物毒素成為人們日漸關注的問題。Campàs等[43]在近期發表的關于生物傳感器檢測海洋毒素——評價海產品的安全性中介紹了海洋毒素的分類以及他們所產生的毒性效應,海洋毒素主要包括：腹瀉性貝毒(DSP),麻痹性貝毒(PSP),記憶缺損性貝毒(ASP),神經性貝毒(NSP),Azaspiracid shellfish poisoning (AZP) toxins(一種新毒素,主要分布在歐洲),雪卡毒素(CFP),河豚毒素(PFP)等幾大類型,綜述了用于檢測這些毒素的生物/分析技術,著重描述了生物傳感器在檢測這些毒素方面的一些應用。這些生物傳感器主要包括：Na+離子通道生物傳感器用于檢測 PSP類貝毒;免疫傳感器用于檢測剛田酸(DSP的一種);酶抑制傳感器用于檢測剛田酸等。展望了生物傳感器作為篩選海產品毒素生物工具的美好前景。近期,Steven等[44]報道的檢測軟骨藻酸的 SPR(表面等離子共振)便攜式生物傳感體系檢測限可達 3 μg/L,定量范圍在4～60 μg/L,此傳感體系可用于濃縮的海藻提取液和海水中高濃度軟骨藻酸的檢測。Marquette等[45]制作了一種化學發光免疫傳感器用于檢測貝類中的剛田酸。目前,在絲網印刷電極上的酶聯免疫測定是毒素測定的一個重要發展方向,這主要是因為絲網印刷電極成本低,適于一次性和室外環境中使用,同時,檢測限可以達到μg/L級甚至更低。生物傳感技術在海洋監測的應用及潛在應用總結在表1中。

表1 海洋中的分析物和使用的傳感器類型總結

3 總結

現代傳感技術是發展海洋監測高技術的發展方向,是海洋現場快速自動監測系統的核心部件,也是制約海洋監測技術水平的主要因素之一。雖然已有很多的傳感體系對海洋分析具有潛在的應用價值,然而專門為海洋測定而設計的傳感器的數目非常少[46-47]。傳感器的應用仍然主要集中在醫療診斷,過程控制,制藥產品,食品安全分析和國防等方面。到目前為止,真正用于海洋環境現場在線監測的傳感器只有溶解氧、電導率、氧化還原電位、濁度、氨氮,而且這些傳感器還有不少技術問題需要解決,特別是用于定點連續長期監測的傳感器。開發和研究適用于海洋監測的生物傳感器,不但可以滿足監測要素的特別需要,還可以反映海洋復雜多變的現狀。通過選擇新的微生物物種以及基因工程和分子生物學的引入,可以大幅度推動生物傳感器的發展。生物傳感器在海水中進行作業,迫使生物傳感器必須提高其選擇性、穩定性、靈敏度等,另外,多種信息的同時獲得要求生物傳感器向集成化發展?？傊?大部分用于海洋監測的生物傳感技術主要存在以下問題：(1)由于海水中多種離子的存在,導致傳感器對某種檢測物的靈敏度和選擇性不夠;(2)海水的高鹽度會對傳感器的外殼以及探頭等造成腐蝕,對用于定點長期監測的傳感器必須解決這一問題;(3)要想監測海洋復雜多變的情況,必須同時監測多個要素,這就要求傳感器要集成大量器件以獲得多個參數。

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