海洋枯草芽孢桿菌HS-A38產直鏈脂肽活性物質的初步檢測

張 歡, 叢麗娜, 侯英敏, 李愛民, 謝三群, 王 丹

(大連工業大學, 遼寧 大連 116034)

海洋枯草芽孢桿菌HS-A38產直鏈脂肽活性物質的初步檢測

張 歡, 叢麗娜, 侯英敏, 李愛民, 謝三群, 王 丹

(大連工業大學, 遼寧 大連 116034)

從海參腸道中分離得到了一株海洋枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HS-A38, 將其發酵上清液經鹽酸沉淀、有機溶劑萃取得到具有廣譜抗菌活性的代謝物質。采用薄層層析和茚三酮顯色檢測到4種物質, 分別命名為化合物1、2、3和4; 應用層析板覆蓋指示菌的生物自顯影技術對其抗菌活性成分進行追蹤、檢測, 結果發現化合物1和2具有顯著抑制弧菌的作用。進一步檢測分析表明, 化合物1、2和 4具有很強的熱穩定性, 初步推斷它們屬于直鏈的脂肽類化合物, 并且這 4種物質出現在不同的發酵代謝時期, 這將為研究群體效應提供基礎檢測依據。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis); 抗菌活性; 生物自顯影; 直鏈脂肽化合物

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)能夠產生多種抗菌代謝產物, 被認為是具有潛在的、能有效抑制病原菌并促進動植物生長的有益菌[1], 具有很高的農用及醫用價值[2]。近年來, 微生態制劑的研究日益受到重視, 關于水產養殖中有益菌抑菌特性的研究也陸續有見報道。儲衛華等[3]將海洋致弧菌(Bdellovibrio)應用于南美白對蝦養殖中疾病的防治,發現該菌能有效預防蝦弧病的發生。郭秀春等[4]研究證明了海綿共棲細菌 NJ6-3-1的代謝物質與種內和種間存在群體感應調控系統。因此, 研究該類菌的抑菌成分, 了解代謝物分泌的基本特點, 這對從水產養殖安全角度考慮利用微生物之間的拮抗作用, 以及探索代謝物產出的生物群體效應研究具有重要意義。

目前已知的枯草芽孢桿菌大多產生環脂肽類(Cyclic lipopeptides)的抗菌物質, 包括枯草菌表面活性素(Surfactin)、伊枯草素(Iturin)和芬枯草素(Fengycin), 這些環肽物質在茚三酮染色前需要酸水解才能顯色, 而對于直鏈的脂肽類物質則可以用茚三酮直接顯色[5,6]。目前對于直鏈脂肽類抗菌物質的報道很少見。本實驗室近年來從海參腸道中篩選得到一株枯草芽孢桿菌HS-A38, 本研究首先檢測了該菌株活性粗提物質的抑菌譜; 應用薄層色譜(TLC),茚三酮直接染色和生物自顯影技術, 檢測到其中的4種物質能與茚三酮直接顯色, 而且其中的兩種化合物具有明顯的抑菌效果。接著檢測了這 4種物質的溫度耐受性和它們產生的代謝時期。這些結果將為下一步活性物質的純化分析和結構確定, 以及生物種內的群體效應的研究提供翔實依據。另外, 該海洋枯草芽孢桿菌 HS-A38的研究和開發, 為今后在水產養殖中生產安全有效的益生菌打下應用基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HS-A38為實驗室自行分離, 其16S rDNA序列在GenBank的檢索號為GQ 466597。

供試指示菌： 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtili)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、志賀菌(Shigellaspp.)、大腸桿菌(Escherichia coli)、副溶血性弧菌(Vibrio parachaemolyticus), 均由本實驗室保存。

1.1.2 培養基

菌株 HS-A38發酵培養基： 葡萄糖 5 g/L, 豆粕粉12 g/L, 尿素1 g/L, 酵母膏0.6 g/L, K2HPO44 g/L,ZnSO40.09 g/L ; pH 7.2～7.4。

指示菌液體培養基： 牛肉膏 3 g/L, 蛋白胨10 g/L, 氯化鈉 5 g/L, pH 7.2～7.4。

指示菌固體培養基： 在指示菌液體培養基中另加入1.5%～2.0%的瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑和儀器

茚三酮、氯化三苯基四氮唑(TTC), 均購自國藥集團化學試劑有限公司, 其他試劑均為進口或國產分析純。E41型紫外掃描儀, 清華紫光股份有限公司;TLC分析板(20 cm×20 cm silica gel 60F254, 德國Merck公司); 制備型硅膠板(10 cm×5 cm, 0.5 mm,青島海洋化工有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株HS-A38抗菌粗品的制備

將菌株HS-A38種子液按5%的接種量分別接入5個 1 L搖瓶中, 裝液量為 200 mL, 共 1 000 mL,30℃、搖床轉速160 r/min下培養48 h后, 將發酵液8 000 r/min離心20 min除去菌體, 上清液用6 mol/L HCl調至 pH 2.0, 放置于 4℃冰箱中過夜; 然后8 000 r/min離心10 min收集沉淀, 用甲醇充分溶解沉淀, 過濾得棕色液體提取物, 接下來蒸干該提取物, 再用丙酮洗滌3次, 得到黃色液體產物; 再濃縮該產物后用飽和正丁醇萃取 3次, 最后取出正丁醇層, 濃縮后得到淺棕色固粗提物體, 即抗菌物質。

1.2.2 菌株HS-A38抗菌粗品的抑菌譜測定

采用紙片擴散法測定菌株 HS-A38抗菌粗品對指示菌的抗菌活性。分別在平板上接種不同的病原指示菌, 涂布均勻, 然后在上面放上無菌濾紙片, 再向紙片上加入過濾除菌的粗品水溶液 20 μL, 并以無菌水作空白對照。經37℃培養 24 h后, 用游標卡尺測定平板上出現抑菌圈的直徑。做3次平行試驗,取平均值。

1.2.3 菌株 HS-A38抗菌粗品的茚三酮和生物自顯影分析

稱取0.1 g活性粗提物溶解于2 mL的甲醇, 各取5 μL點樣于兩塊TLC分析板上, 分別同時在展層缸中展開(氯仿： 甲醇： 水=65： 25： 4); 干燥后, 其中一塊薄板用 0.5%茚三酮水溶液直接染色, 高溫吹干顯色, 掃描并保存。另一塊采用生物自顯影技術[7,8], 并針對本實驗的特點進行方法改良： 即將薄板置入紫外燈下滅菌 20 min, 然后放入無菌培養皿中, 再將一定濃度的弧菌菌懸液均勻涂布在上面, 37℃培養18 h, 再在薄板上噴上無菌的 0.005%TTC溶液, 接著繼續培養3～4 h, 觀察顯影斑點并照相。

1.2.4 化合物1和2的分離及活性檢測

為了分離大量的活性化合物1和2, 采用制備型層析板制取技術。取上述粗提物質甲醇溶解液 100 μL, 點樣在制備板上, 每點取10 μL; 該板經展開劑(氯仿： 甲醇： 水=65： 25： 4)展開后, 干燥; 以其中一個點樣的茚三酮顯色區域為標準, 確定化合物1和2的位置, 再將與此斑點對應的制備板區域的硅膠刮取出來, 用甲醇充分溶解, 離心除去硅膠粉, 得到待檢測的活性物質。將該提取物分別點樣于兩塊 TLC板, 用原粗提物甲醇溶解液作為對照, 展層后干燥,其中一塊板經 0.5%茚三酮水溶液染色, 高溫顯影,照相并保存, 另一塊板采用上述生物自顯影技術顯影檢測活性。

為了進一步驗證化合物1和2是否具有活性, 分別將這兩種化合物的甲醇溶解液過濾除菌, 然后自然揮發甲醇, 得到的化合物 1和2再用無菌水溶解;接著采用平板對峙法檢測其活性[9]： 即在均勻涂布含弧菌的平板上, 放置 0.8 cm滅過菌的濾紙片, 在濾紙片上滴加15 μL的活性樣品1和2, 并以無菌水為對照, 37℃培養24 h后觀察是否出現抑菌圈。

1.2.5 脂肽類物質溫度耐受性的檢測

取上述粗提物的甲醇溶解液各 100 μL, 加入 5支無菌 EP管中, 分別置于 40、60、80、100℃保溫30 min, 余下的一支管放入滅菌鍋, 經1×105Pa滅菌20 min。然后, 每樣取15 μL點樣于TLC板上, 以未處理的樣品為標準, 展層干燥后再茚三酮染色顯影。根據顯影情況推斷 4種脂肽類物質對溫度的耐受性。

1.2.6 脂肽類產物發酵代謝時期的測定

將斜面保存的HS-A38菌種接種到30 mL液體培養基, 30℃、160 r/min振蕩培養16 h。培養液經8 000 r/min離心20 min, 收集菌體。用20 mL無菌生理鹽水稀釋該菌體, 然后取稀釋的菌體液按照5%的接種量接種于50 mL的液體發酵培養基中, 30℃,160 r/min振蕩培養19 h。之后每隔3 h取樣6 mL, 其中1 mL用稀釋涂布法測各樣品的菌體濃度, 以繪出HS-A38的生長曲線; 剩下的5 mL發酵液樣品, 按照1.2.3的方法萃取得到含活性物質的正丁醇萃取液,然后點樣于 TLC分析板, 展層干燥后茚三酮顯影,以檢測4種脂肽類物質分泌產生的發酵時段。

2 結果與分析

2.1 菌株HS-A38抗菌粗品的抑菌譜

采用紙片法對菌株 HS-A38 的粗體物水溶液進行抑菌譜實驗?？咕钚越Y果(表1)表明, 該粗提物質對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、志賀菌、枯草芽孢桿菌和溶壁微球菌均有很強的抑制作用, 并且對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和副溶血性弧菌也具有較好的抑菌作用。

表1 菌株HS-A38粗品的抑菌活性Tab. 1 Antimicrobial activity of the crude extract from Strain HS-A38

2.2 茚三酮染色和生物自顯影分析

根據化合物 N端的游離氨基酸能與茚三酮發生顏色反應, 實驗首先采用茚三酮染色直接顯影技術。結果如圖1所示, 共有4個斑點, 將各斑點對應的物質分別命名為化合物1、2、3和4。根據枯草芽孢桿菌代謝產物的報道, 初步推斷這 4種物質為直鏈的肽類化合物[10]。為了驗證這 4種物質是否具有生物活性, 采用生物自顯影技術跟蹤, 以 TTC溶液作為檢測指示菌活細胞的生物顯色劑, 即一定濃度的TTC和活菌體內的琥珀酸脫氫酶反應, 生成紅色的還原產物, 使菌落變紅色[11]。通過抑菌斑點檢測這些化合物在層析板上的位置及活性大小。結果發現, 在A到B區間內有明顯的抑菌斑點, 而A與 B區間對應的為化合物 1和 2(圖2)。因此初步推斷, 化合物1和2即為活性成分。

2.3 化合物1和2的分離及活性檢測

為了確定化合物1和2是否具有抗菌活性, 采用制備型層析板, 得到化合物質1和2。再用甲醇溶解樣品, 經TLC檢測, 分離結果如圖3所示。在TLC板上能明顯觀察到化合物1和2的單一斑點, 這說明這兩種物質已得到了很好的分離; 另一塊板再經生物自顯影檢測化合物1和2的抑菌活性, 結果如圖4所示?；衔?和2點樣的b和c泳道均出現了抑菌斑點, 表明這兩種物質確實有生物活性存在。

為了進一步驗證自顯影技術的可靠性, 再采用紙片法檢測并驗證化合物的活性。以弧菌作為指示菌, 將化合物1和2滴加在無菌的濾紙片上, 培養一段時間后, 這兩種物質各自的周圍均出現了抑菌圈(圖5)。從而表明化合物1和2確實具有抗菌活性, 而且生物自顯影技術能夠直接檢測到活性物質的位點。

圖1 菌株HS-A38粗提物質TLC圖譜Fig. 1 TLC of the crude extract of Strain HS-A38

圖2 菌株HS-A38粗提物質生物自顯影Fig. 2 TLC-Bioautography of the crude extract of Strain HS-A38

2.4 脂肽類物質溫度耐受性的影響

在確定了活性物質在TLC板上的遷移率和顯影特點后, 采用 TLC法檢測活性物質經不同溫度處理后的顯影情況。如圖 6所示, 對比未處理過的樣品a, 各樣品在經過40、60、80、100℃處理后, 活性物質1和2、化合物3和4仍然能夠保持顯影特性, 這說明大部分的脂肽類物質具有很好的抗熱性; 同時, 樣品在 121℃高溫高壓處理后, 僅有物質 3的顯影消失,活性物質1和2、化合物4的顯影斑點只是變淺, 說明大部分的脂肽類物質還具有耐高溫和高壓力的特性。

圖3 化合物1和2的TLC圖譜Fig. 3 TLC of the active substances

圖4 化合物1和2的生物自顯影Fig. 4 TLC-Bioautography of the active substances

2.5 脂肽類物質發酵代謝時期分析

通過TLC板檢測和分析菌株HS-A38發酵產生活性物質和代謝時期的關聯性。根據測定的菌株HS-A38部分生長曲線(圖 7)和對應的不同時期發酵液活性物質檢測的TLC圖譜(圖8), 可知活性物質1和 2出現在發酵生長的末期, 因此它們屬于次級代謝產物; 而化合物3出現在發酵的對數期末期, 化合物 4出現在發酵穩定期, 因此這兩種化合物均屬于初級代謝產物。實驗表明, 應用 TLC技術和茚三酮顯影可以直接檢測到直鏈化合物的分泌時期, 這將為后期的代謝物群體效應的研究提供檢測依據。

圖5 化合物1和2對副溶血弧菌的抑制作用Fig. 5 Antimicrobial activities of the compounds 1 and 2 against V. parachaemolyticus

圖6 溫度對脂肽類物質的影響Fig. 6 Effect of temperature on the liner lipopeptides

3 結論與展望

菌株 HS-A38分離來自海參腸道, 屬于枯草芽孢桿菌(B. subtilis), 其發酵液通過鹽酸沉淀、有機溶劑萃取分離, 采用茚三酮直接染色, 發現4種化合物,并應用生物自顯影技術快速跟蹤、檢測, 發現兩個具有抗弧菌的活性物質1和2。這4種物質能與茚三酮直接顯色, 表明其結構上含有游離的氨基酸, 初步說明它們是線性的脂肽類化合物。進一步研究表明這類化合物對溫度耐受性高, 這一點在對化合物進行加工過程中因加熱而減少損失極為有利。近年來,關于耐藥基因的報道使人們越來越關注和意識到水產和畜牧業中細菌抗藥性的產生直接威脅了人類健康和生命安全[12]。本實驗產生菌來自可食用的生物活體體內, 具有安全, 可靠的特點, 而且屬于水產有益菌常見芽孢桿菌屬, 并表現出廣譜的抗菌活性,因而是具有很大潛能的有益菌。在研究代謝物質產生與發酵時期的關聯性時, 發現其中化合物3和4出現在發酵對數期, 而活性物質出現在發酵末期, 這可能存在一種群體感應信號刺激代謝物的產生, 這一類研究群體種內和種間與抗菌代謝物分泌效應的調控機制已成為現在研究的熱點[13]。本次實驗找到了一種跟蹤活性物質發酵代謝的檢測方法, 這將為進一步的提取和檢測提供依據。

圖7 菌株HS-A38生長曲線Fig. 7 Growth curve of Strain HS-A38

圖8 脂肽類物質代謝時期TLC檢測Fig. 8 TLC detection of liner lipopeptides at various fermentation stages

[1]Bais HP, Fall R, Vivanco J M. Biocontrol ofBacillus subtilisagainst infection of arabidopsis roots by pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production [J]. Plant Physiol, 2004,134(1)： 307-319.

[2]Stein T.Bacillus subtilisantibiotics： structures, syntheses and specific functions [J]. Mol Microbiol, 2005,56(4)： 845-857.

[3]儲衛華, 朱衛, 康春濤. 海洋致弧菌的分離鑒定及其對副溶血弧菌的作用[J]. 微生物學通報, 2009, 36(1)：20-24.

[4]郭秀春, 鄭立, 崔志松, 等. 海綿共棲細菌 NJ6-3-1基于群體感應調控的抗菌活性[J]. 微生物學報, 2008,48(4)： 545-550.

[5]侯紅漫, 靳艷, 金美芳, 等. 環脂肽類生物表面活性劑結構、功能及生物合成[J]. 微生物學通報, 2006,33(5)： 122-128.

[6]裴炎, 李先碧, 彭紅衛, 等. 抗真菌多肽 APS-1的分離純化與特性[J]. 微生物學報, 1999, 39(4)： 344-349.

[7]Zhang Y, Mu J, Gu X, et al. A marine sulfate-reducing bacterium producing antibiotics： biological and chemical investigation [J]. Mar Drugs, 2009, 3： 341-354.

[8]何佳, 趙啟美, 陳鈞. 利用二維生物自顯影技術快速檢測追蹤金錢松內生真菌抗細菌活性成分[J]. 食品科學, 2008, 29(2)： 252-256.

[9]邱服斌, 李雁津, 張曉霞, 等. 人參內生細菌ge21菌株的鑒定及抑菌活性測定[J]. 微生物學通報, 2010,37(1)： 43-47.

[10]白士茂. 氯化三苯基四氮唑對細菌生長指示的適用性研究[J]. 浙江實用醫學, 1997, 2： 12-13.

[11]趙秀香, 趙柏霞, 馬鏑, 等. 枯草芽孢桿菌 SN-02抑菌物質的分離、純化及結構鑒定[J]. 植物保護學報,2008, 35(4)： 322-326.

[12]Schwarz S, Kechrenberg C, Walsh TR. Use of antimicrobial agents in veterinary medicine and food animal production [J]. Int J Antimicrob Agents, 2001, 17(6)：431-437.

[13]郭鵬飛, 張海濤, 張衛, 等. 共培養海綿微生物誘導抗菌活性物質的研究[J]. 微生物學通報, 2006, 33(1)：33-37.

Antimicrobial activity of liner lipopeptides produced byBacillus subtilisHS-A38

ZHANG Huan, CONG Li-na, HOU Ying-min, LI Ai-min, XIE San-qun, WANG Dan
(Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

Oct., 11, 2010

Bacillus subtilis; antimicrobial activity; bioautography; liner lipopeptides

A marineBacillus subtilisstrain HS-A38 was isolated from the sea cucumber intestine. The crude extract of fermentation broth was prepared by methods of hydrochloric acid precipitation and solvent extraction. The extract showed broad-spectrum antimicrobial activity using the paper disc agar diffusion method.Four components, named as compound 1, 2, 3, and 4 were found by the thin layer chromatography and ninhydrin color printing. The compounds with antimicrobial activity were detected and tracked by bioautography ofVibrio parahaemolyticusand triphenyltetrazolium chloride (TTC) coloration on the plate of thin layer chromatography. Two inhibition spots were found, corresponding to compound 1 and 2. The further study showed that the compound 1, 2, and 4 were stable at high temperature. Therefore, it was preliminarily deduced that the four compounds were all straight-chain lipopeptide produced at different phase of fermentation.

S917.1

A

1000-3096(2011)08-0037-06

2010-10-11;

2011-03-02

國家自然科學基金項目(31072224) , 遼寧省教育廳創新團隊資助項目(LT2010012); 遼寧省自然科學基金項目(20102009)

張歡(1984-), 男, 湖北孝感人, 碩士研究生, 研究方向：海洋微生物生物活性物質, E-mail： lsm52421@yahoo.com.cn; 叢麗娜,通信作者, E-mail： congln@dlpu.edu.cn

康亦兼)