高等植物及藻類植物中cAMP研究進展

鄧海臨,李大鵬

(1.福建農林大學 食品科學學院,福建 福州 350002;2.中國科學院 海洋研究所,山東 青島 266071)

Sutherland在研究腎上腺素引起肝細胞中糖原分解成葡萄糖時發(fā)現,如果使腎上腺素和分離出來的細胞膜碎片互相作用,可生成一種當時不知名的小分子物質,當把這種物質單獨和肝細胞的胞漿接觸時,也能引起胞漿中糖元的分解,其作用和腎上腺素作用于完整的肝細胞時類似。這說明腎上腺素并不是直接作用于糖元,而是作用于細胞膜上,促使其生成小分子物質的結果。這種小分子物質就是后來證明的cAMP(環(huán)腺苷酸)。cAMP的發(fā)現徹底改變了人們對新陳代謝調節(jié)機制的認識,人們把蛋白激酶和磷酸化作用以及去磷酸化作用調節(jié)蛋白質活性的系統歸為生物信號轉導中的第二信使系統之一。cAMP作為第二信使普遍存在于細菌、真核微生物、真菌以及多細胞動物,此外,對外界信號作出的一系列細胞反應都與cAMP有關。由于植物中cAMP含量通常較低,一般的檢測方法難以達到要求,隨著酶聯免疫法、液相色譜法、質譜法等新型精確檢測方法的應用,使得植物細胞中含有 cAMP得到肯定,也使海藻中cAMP的研究得到了較快的發(fā)展。

1 cAMP信號系統的組成

1.1 腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase,AC)

AC是合成cAMP的關鍵酶類,目前已知有9種腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase,AC)異構體。根據AC氨基酸序列,至少可分為兩種亞類。各種AC異構體表達的組織特異性會影響不同組織在特異刺激下合成cAMP的量。除了由G蛋白激活,AC也能整合G蛋白的βγ亞基、蛋白激酶 C以及細胞內鈣離子等轉導的信號。

目前,通常使用組織化學和生物化學方法檢測植物組織中的 AC活性。組織化學法主要基于標準Wachstein-Meisel法磷酸鉛沉淀技術[1],以ATP作為AC的底物,用電子顯微鏡檢測ATP形成cAMP過程中產生的 PPi與鈰形成電子致密沉淀物的量來代表AC的活性。因為細胞含有大量ATP水解酶不斷地釋放 Pi,在這一過程中產生許多假陽性反應,很多化合物都不能避免干擾活動。后來采用對ATP酶敏感較低的 5'-三磷酸亞酰胺腺苷代替 ATP作為底物[2],運用這種方法,最早在細胞質膜中發(fā)現AC的活性。此外,在玉米根尖內質網、質膜、核膜[3]以及豌豆內膜[4]上都檢測到AC活性。植物學家發(fā)現AC的許多生理作用。Rougier[5]提出AC活性是楊樹花粉管穩(wěn)定形成的重要因素,Curvetto[6]在蠶豆保衛(wèi)細胞中定位了AC活性是由IAA、Ca2+、咖啡因、GTP等激活的。作者認為在一定程度上 cAMP參與了氣孔運動中由G蛋白引起的 IAA信號轉導體系。此外,在菜豆初生葉的細胞質膜外和類囊體膜中也發(fā)現了 AC的活性,另一項研究通過免疫定位在葉綠體和細胞壁中發(fā)現了cAMP[7]。

組織化學方法難以精確定位AC活性,只能揭示其在生理過程中有一定的作用。生物化學方法實際上是用放射性同位素標記cAMP的前體(ATP或者5'-三磷酸亞酰胺腺苷)測定合成放射性具有cAMP的含量來檢測AC的活性。不過早期的研究因無法檢測新合成的化合物而遭到質疑,隨著更加精確的分離技術的發(fā)展,生物化學方法提供更加可靠的證據。例如,Carricarte[8]初步估計了苜蓿(Medicago sativaL.)中水溶性AC的分子質量為84 ku,并發(fā)現AC的活性依賴于 Ca/CaM 與 G蛋白的功能無關。相比之下,Lusini[9]在蓖麻根中檢測到 AC的活性。酶活性大約在20 pmol/(min·mg),而AC的活性與G蛋白和NaF有關,AC可能受 G蛋白調控。運用質譜分析技術Pacini[10]在豌豆中檢測到AC活性。AC用Mg2+-ATP作為底物合成cAMP,AC的活性與GTP存在很大關聯。低濃度的GTP激活AC活性,而過高濃度的GTP抑制其活性,這可能是因為與 ATP競爭造成的。Cooke[11]在研究紫花苜蓿細胞組織時發(fā)現,植物黃萎病致病菌激發(fā)AC的活性。AC的活性依賴于Mg2+由 Ca2+激發(fā)。較低活性的 AC在加入植物黃萎病致病菌后,AC活性瞬間升高了3倍。AC活性的短暫性升高同時伴隨著細胞內 cAMP含量升高,隨后磷酸二酯酶活性快速升高。

1.2 磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)

磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)負責降解細胞內 cAM P,目前已知有 40種以上 PDE,可分為七類。某些組織中AC基礎活性很高,這時PDE在調節(jié)cAMP信號途徑中的作用就很重要了。除了可以活化已有的 PDE酶類, cAMP也誘導合成新的 PDE mRNA,但目前這種調控節(jié)的分子機制尚未明了。

早在高等植物中提取環(huán)核苷酸混合物的報道之前,Wood[12-13]在豌豆苗種發(fā)現cAMP被PDE水解成AMP,隨后在煙草、胡蘿卜葉、大麥種子、馬鈴薯、洋姜塊莖中發(fā)現了 PDE的活性。諸多的研究表明,cAMP是植物組織中內源性物質,其擁有的功能與其他生物體中類似。與此不同的是,Lin等[14]在豌豆苗中發(fā)現PDE活性具有最佳pH,并且對甲基黃嘌呤不敏感,水解得到3'-AMP而不是5'-AMP。更重要的是,把RNA分解中間物2',3'-cAMP作為底物而不是第二信使系統中的3',5'-cAMP。因為在動物體中PDE作用于cAMP第二信使系統只產生5'-AMP并不水解2',3'-cAMP,由此推斷出豌豆中的PDE并不在植物信號轉導中發(fā)揮作用,只是作為RNA分解代謝的一部分。

1.3 蛋白激酶 A(cAMP-dependent protein kinase A,PKA)

PKA全酶是一種四聚體,由兩個催化亞基(C)和兩個調節(jié)亞基(R)構成。在沒有 cAMP時,以鈍化復合體形式存在。cAMP與調節(jié)亞基結合,改變調節(jié)亞基構象,使調節(jié)亞基和催化亞基解離,釋放出催化亞基。活化的蛋白激酶A催化亞基可使細胞內某些蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化,于是改變這些蛋白的活性,進一步影響到相關基因的表達。

在真核生物中,cAMP的功能主要是由蛋白激酶對靶蛋白的磷酸化實現的。但近來又有實驗證明cAMP 可以直接作用于離子通道。目前,植物細胞中的研究主要集中在對 cAMP依賴型蛋白激酶的查尋上。雖然尚未從植物組織中純化出 cAMP依賴的蛋白激酶 A,但在多種植物的提取物中證明依賴于cAMP磷酸化作用是存在的,如浮萍、玉米、椰子和水稻等[15-17]。現已在幾種植物中發(fā)現有類似動物PKA 的調節(jié)亞基(即 cAMP 的結合蛋白)和催化亞基。而且近年來報道的幾個植物蛋白激酶基因與動物中PKA和蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)催化亞基高度同源[17-18]。雖然植物與動物PKA 的催化亞基相似,cAMP 能激活 PKA 的催化亞基,但并不能完成調節(jié)亞基的抑制作用,所以植物體內可能還需其他酶的協助功能完成PKA 的調節(jié)功能。

1.4 cAMP調控的離子通道(cyclic nucleotide-gated channels)

在植物中建立以蛋白激酶A為主要目標和因素研究環(huán)核苷酸信使系統存在一定的困難,植物中cAMP調控的離子通道(CNGCs)是研究環(huán)腺苷酸信使系統的理想體系[19]。CNGCs是許多植物中一組運輸蛋白質的離子通道,另外其只由環(huán)腺苷酸激活。擬南芥CNGCs中就存在至少20種基因[20]。

通過對CNGCs的功能分析發(fā)現,擬南芥中胞外高濃度的 Ca2+抑制 K+的運動來調控 K+、Ca2+和其他一價陽離子的運動,并且對 K+、Ca2+的調控都依賴于cAMP和cGMP[21]。除此之外,植物CNGCs含有相同的鈣調蛋白結合域(CaMBD),但是不同的CNGCs擁有不同的鈣調蛋白結合能力[22]。然而鈣調蛋白與CNGCs的結合依賴于Ca2+并由cAMP激活。因此,Ca2+與鈣調蛋白和環(huán)核苷酸的相互作用彼此相關聯,另外CNGCs與胞內鈣調蛋白和環(huán)核苷酸信號共同形成胞內信號轉導通路。

環(huán)核苷酸和離子通道共同參與了植物體內眾多生理活動。根據Kurosaki[23]的研究顯示,cAMP直接調控K+通道,K+受cAMP激發(fā)流入胡蘿卜細胞內同時伴隨著 Ca2+的快速轉移,此外還有進一步的研究顯示出cAMP和cGMP在調控氣孔開啟具有一定的作用,這涉及了多組離子通道。雙丁酰cAMP引起百合花粉管中胞內 Ca2+濃度的升高,光解釋放 cAMP使花粉管頂端彎曲,并使儲存Ca2+的釋放。Ca2+的分布遷移是控制頂端生長的一個重要原因,而 cAMP是調節(jié) Ca2+分布的主要因素[24]。這些通道涉及的離子運動是否是CNGCs還不能確定,cAMP是直接或是間接影響離子通道的活性,影響它們的磷酸化也尚不明確,這些都需要進一步的研究。

2 cAMP的生理功能

在植物界中,對海藻的研究給我們提供了較好的研究 cAMP生理功能的材料,例如 cAMP調控衣藻(Chlamydomonas eugametos)有性生殖和纖細裸藻的生理節(jié)奏。在海藻的研究中發(fā)現 cAMP的合成和分解機理,最近已經從纖細裸藻(Euglena gracilis)中成功克隆 cAMP蛋白激酶基因[25]。盡管植物細胞中cAMP信號系統的某些成分在基因水平上尚未分離,但研究表明cAMP具有多種生理功能。與cAMP相關的生理功能的相繼發(fā)現,為植物細胞中存在cAMP信號途徑積累了越來越多的實驗證據。

細胞內cAMP的變化及cAMP相關酶生理作用的報告顯示,植物當中大量的生理活動都與 cAMP的變化有關[26-28]。人們發(fā)現 cAMP在多種植物生理活動發(fā)揮作用例如離子傳輸。cAMP在葉綠體中也顯示具有重要的作用,目前已經發(fā)現 cAMP在該細胞器中完整的運行機制。

2.1 調節(jié)植物細胞生理周期

研究發(fā)現,cAMP在眾多生理過程中發(fā)揮極其重要的作用。Ehsan[29]報道cAMP與煙草BY-2細胞的細胞分裂周期密切相關。細胞在S期時,cAMP的含量達到最高在G1期時含量相對較低。在加入吲哚美辛(一種腺苷酸環(huán)化酶抑制劑)之后[30],引起細胞S期cAMP含量的降低,并伴隨減弱細胞的有絲分裂。作者認為在細胞分裂過程中存在一種前列腺素或前列腺素類似物(素馨酮酸)激活腺苷酸環(huán)化酶。

越來越多的研究顯示 cAMP在動物及真菌細胞分裂周期中發(fā)揮重要作用。cAMP含量在連續(xù)的細胞分裂周期中發(fā)生變化,在不同細胞類型中 cAMP顯示出具有刺激或抑制細胞增值的作用。在細胞 S期之前,cAMP含量的瞬時升高是引起DNA合成的原因之一。這說明 cAMP作用于細胞分裂過程中重要的細胞分裂調解素。釀酒酵母細胞分裂周期也受到Ras/cAMP信號轉導途徑的高度調控[31]。

cAMP在調節(jié)纖細裸藻(Euglena gracilis)細胞生理節(jié)奏發(fā)揮重要的作用[32-33]。Edmunds[34]認為通過G1/S和G2/M的協調轉變從而形成生物鐘和細胞分裂周期之間的聯系。一項腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶的研究顯示,AC活性的變化受到其酶活性調節(jié)器的調節(jié)而不受酶數量的影響。在白天的任何時候加入毛喉素(forskolin)都能最大程度的激活腺苷酸環(huán)化酶活性,此外還能減小 cAMP含量變化的幅度以及減少細胞分裂過程中的節(jié)律性。IBMX的實驗發(fā)現磷酸二酯酶活性受時間段的抑制。然而,IMBX也是各種磷酸二酯酶活性的抑制劑,只是程度上各不相同而已。正是由于這個原因導致細胞周期中存在各種磷酸二酯酶,其中某種特別的磷酸二酯酶可能是cAMP變化產生的原因。

在研究生物鐘影響cAMP含量的過程中,Tong[35]研究了Ca2+、鈣調蛋白、三磷酸肌醇和 cGMP在腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶中的調節(jié)作用。cGMP含量的變化先與 cAMP含量變化。cGMP及其類似物同樣對腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶存在一定的影響。因此可以看出cGMP是cAMP代謝的調節(jié)者。

cAMP對細胞分裂周期產生的影響主要是延緩或加速細胞周期。在細胞生物鐘的白天時段加入cAMP會導致細胞分裂周期的延緩,而在夜晚時段加入 cAMP則會加速細胞分裂周期的循環(huán)。這主要是由于細胞中存在多種不同的 cAMP受體選擇性的調節(jié)一個或多個調控途徑所致。在纖細裸藻中發(fā)現兩種cAMP蛋白激酶(cPKA和cPKB)與cAMP及其類似物聯系各不相同[36]。通過 Edmunds[34]的實驗發(fā)現,cAMP含量的增加會抑制DNA的合成,使細胞分裂停留在G2期,因此抑制了細胞分裂。當cAMP含量減少的時候,對細胞分裂的抑制現象消失了。我們推測細胞分裂周期從G2到M的轉變及整個有絲分裂過程都受 cAMP的影響。cAMP對細胞分裂周期的延緩作用受 cPKA調控,對細胞周期的加速作用則由cPKB調控。由此可見,cPKA和cPKB在細胞分裂周期中的表達有所不同,至于在什么時段表達什么蛋白激酶還在研究當中[37]。

2.2 參與植物抗病

許多研究顯示植物在抗病毒過程中受 cAMP的調控。這種應激反應系統和動物第二信使系統中的胞外信號、信號受體、及其反應機制類似[38]。已發(fā)現多種胞外誘導子,包括多糖、低聚糖、脂肪酸、蛋白質和糖蛋白;另外還發(fā)現了少數信號受體,都是一些分布在細胞質膜上的蛋白質。信號受體對外界刺激做出的反應的同時激活特殊的防御反應基因,并誘導植物抗毒素的合成酶的產生。細胞質膜這種接收信號的機制轉接到核基因,已經多方面的運用到Ca、素馨酮酸、活性氧、甘油二酯和磷酸肌醇、cAMP[39]。

Oguni首次在甘薯中發(fā)現 cAMP調控細胞防御體系合成植物抗毒素[40],之后在胡蘿卜中也發(fā)現植物抗毒素的增加伴隨著細胞內 cAMP含量的升高[41]。研究表明,cAMP參與了苜蓿(Medicago sativaL.)抗黃萎病合成植物抗毒素所作出的應激反應[42],苯基丙氨酸解氨酶(PAL)的活性也大幅提高催化植物抗毒素合成的前期反應。經過雙丁酰 cAMP處理的苜蓿幼苗苯基丙氨酸解氨酶活性提高,并促進美迪紫檀素(medicarpin)的合成[43,11];通過 FAB/MIKE光譜分析發(fā)現在細胞內源性 cAMP在經病原激發(fā)子處理后含量升高了 4～5倍。雖然在胡蘿卜細胞中也發(fā)現了上面類似的現象,但是苜蓿幼苗經病原激發(fā)子處理后3～5 min cAMP含量就達到了最高水平,而胡蘿卜則在 30 min后才體現出 cAMP含量的升高,四季豆需要15min達到最高反應水平[44]。在苜蓿中,AC刺激反應的增強和減弱都隨著磷酸二酯酶的變化而變化。胡蘿卜中霍亂毒素刺激其植物抗毒素的合成以及激發(fā)四季豆中苯基丙氨酸解氨酶的活性與都G蛋白有關[45]。

以上的研究顯示 cAMP與植物合成抗毒素反應的過程,但是究竟如何調控植物抗毒素合成還不明確。AC對Ca2+的敏感性[11]以及cAMP對離子通道的調控作用[23],均顯示cAMP的作用是通過AC/cAMP和IP3/ Ca2+途徑的對話而起作用的。盡管在胡蘿卜細胞中沒有明顯的檢測到對 cAMP響應的蛋白激酶活性,但是Ca2+和鈣調蛋白可以快速激活。根據這些結果,我們可以推測,病原激發(fā)子誘導的cAMP增加可引起 Ca2+的內流,Ca2+再進一步激活蛋白激酶的活性[24]。

2.3 對藻類有性生殖過程的調控

Pasquale等[46]在研究萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhaidtii)雌雄配子粘合過程中發(fā)現胞內cAMP含量短暫性的升高了10倍,在單一生殖性型配子中加入外源性雙丁酰 cAMP之后可以引起雌雄配子粘合時產生的相似反應,如細胞壁的消失,鞭毛頂端的激活等。并且加入環(huán)核苷酸磷酸二酯酶抑制劑后加強外源性 cAMP的促進作用,在配子細胞和鞭毛中發(fā)現了腺苷酸環(huán)化酶的活性。類似的 Pijst[47]在研究卵配衣藻正負生殖型的配子混合在一起時,在粘著發(fā)生20s后觀察到細胞內cAMP含量快速升高,并且把一生殖型的配子中加入另一種生殖型的配子的離體的鞭毛時也能引起細胞內 cAMP數量的短暫性的升高。由于這種 cAMP濃度的提高先于細胞融合時所有形態(tài)學和生理學的改變,推測它可能是由性粘著誘導的第一個主要的反應。Gilles[48]分別用結合蛋白實驗和高效液相色譜法分析了團藻性組織細胞中的cAMP含量比普通組織細胞中高,發(fā)現過高濃度的cAMP會抑制有性生殖的性誘導,性組織的細胞僅當結合時,cAMP 濃度才會升高。在非誘雄性藻株中10倍或20倍的cAMP 濃度升高會導致其不育,由此可見 cAMP作為復雜的性誘導物質中的一員在細胞基質中發(fā)生作用。

3 cAMP含量變化機制的研究

cAMP系統的機能活動的研究主要是通過對內源性 cAMP含量的檢測來實現的。早前運用較廣泛的是Gilman的蛋白結合檢測法,這種方法基于同位素標記的 cAMP(8-3H-cAMP)與環(huán)核苷酸樣品共同競爭特異結合蛋白,cAMP蛋白激酶就是這種特異蛋白之一[49]。放射免疫檢測法也是常用的方法,抗體結合過量標記的抗原,通過檢測未標記的抗原取代標記的具有放射性的抗原的數量來計算 cAMP的含量。質譜、高效液相色譜及其他生物熒光方法就顯得相對復雜,但是能較好地追蹤活體細胞中 cAMP的變化[50]。此外酶免疫檢測法則使用的相對更少,標記與未標記抗原共同競爭多克隆抗體,反應完全之后加入到含有堿性磷酸酶標記的第二抗體的平板中,酶活力的大小就反映所檢測 cAMP的濃度[51]。這些技術運用得出的大量數據為植物體內 cAMP系統的研究積累了充足的證據。

cAMP作為第二信使并能引起相應的反應在植物細胞中普遍存在,當細胞受到外界刺激時,胞外信號分子首先與受體結合形成復合體,然后激活細胞膜上的 Gs-蛋白,被激活的 Gs-蛋白再激活細胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶(AC),催化 ATP脫去一個焦磷酸而生成 cAMP。生成的 cAMP作為第二信使通過激活PKA(cAMP依賴性蛋白激酶),使靶細胞蛋白磷酸化,從而調節(jié)細胞反應,cAMP最終又被磷酸二酯酶(PDE)水解成5’-AMP而失活。AC和PDE可以從兩個不同方面調節(jié)細胞內cAMP濃度,從而影響細胞、組織、器官的功能。當AC的活性升高時,cAMP濃度升高,當PDE濃度增高時,cAMP濃度降低。PDE對cAMP的調控,不僅取決于PDE的活化、抑制因素,還與細胞內PDE的組成、亞細胞分布有關。

Goodenough[52]在研究cAMP對衣藻鞭毛雌雄配子粘合作用時,發(fā)現雌雄配子粘合引起凝集素的相互作用,并最終導致 cAMP含量的升高。此外Kooijman[53]將麥胚凝集素加入到衣藻中促使雌雄配子鞭毛粘合,鞭毛上的錨蛋白(可能通過G蛋白)激活腺苷酸環(huán)化酶催化 ATP形成 cAMP。Francisco[54]在研究光調節(jié)幾種大型海藻(網地藻、石花菜、石莼)cAMP含量時發(fā)現,這幾種海藻在紅光和遠紅外光的照射下,并未發(fā)生光敏反應 cAMP含量有一定的升高,在白光照射下cAMP含量大幅升高,在一定范圍內 cAMP含量隨著光照強度升高而升高,因此他們推測其 cAMP含量的積累受光合效能的調節(jié),而不受光敏素的影響。由此可以看出,cAMP很大程度上受新陳代謝產生的 ATP的影響,而光合作用產生cAMP的前體例如ATP,但是cAMP含量的降低是否與ATP合成的抑制有關還不能確定。

4 小結

綜上所述 cAMP信使系統是生物體調控眾多生理過程的主要信息傳遞系統,調節(jié)活動過程中出現細胞內的 cAMP含量的變化,證明了 cAMP在調節(jié)機體整體活動的協調性和精確性等方面所起的主要作用。目前對藻類細胞內的 cAMP信使系統研究較少,只集中在幾種衣藻和單細胞微藻當中;此外,對于 cAMP的研究只僅限于其含量變化,對 cAMP的相關酶及其結合蛋白的研究則幾乎為零,因此對cAMP的調控機制還需要進行廣泛而系統的研究。除了檢測生理過程中cAMP和cAMP相關酶活性的波動變化之外,對cAMP響應的蛋白激酶、結合蛋白和他們的靶目標將是今后研究的主要重點。另外,質譜、生化分析、免疫組織化學技術、結合高壓冷凍技術及分子蒸餾法的運用將有助于 cAMP和 cAMP結合位點的亞細胞定位,用細胞化學分析方法對AC酶進行定位;采用分子生物學技術分析 AC和 PDE的基因結構,用反義或RNA干擾技術抑制這些酶控制的 cAMP瞬間升高變化,同時用 cAMP類似物調控激酶或cAMP 結合位點的活性等。

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