力竭運動后大鼠大腦皮質結構與NGF、TrkA動態變化的研究

楊澎湃

(成都體育學院，四川 成都 610041)

力竭運動后大鼠大腦皮質結構與NGF、TrkA動態變化的研究

楊澎湃

(成都體育學院，四川 成都 610041)

目的:探討SD雄性大鼠在一次性力竭運動后，大腦皮質微結構和超微結構的形態改變與神經生長因子NGF、受體TrkA的動態變化關系。方法:隨機將大鼠分為對照組(C組)、一次性力竭游泳運動后即刻組(E1)、12h組(E2)、24h組(E3)、48h組(E4)，灌注定位取出大腦皮質，運用HE染色、鈾鉛雙染，在光、電鏡下觀察大腦皮質結構變化，運用免疫組化技術檢測大腦皮質中NGF和TrkA表達變化。結果:NGF、TrkA表達水平較C組顯著性上升(P＜0.05);E2組的NGF、TrkA的表達水平較E1組下調，其中TrkA的表達下調顯著(P＜0.05);NGF、TrkA的表達上升最為顯著，較C組(P＜0.01);E4組繼續維持著高表達，較C組(P＜0.01)。結論:一次性力竭運動后大腦皮質結構的損傷和重塑與NGF、TrkA動態表達具有一定的聯系性。

大腦皮質;力竭運動;NGF;TrkA

目前，疲勞消除的研究既是運動醫學領域的一大熱點，也是運動實踐中亟待解決的一大難點。而一次性力竭運動是指動物或人進行運動直到再也不能運動為止，肌肉或器官完全不能維持運動狀態，是疲勞不斷發展的最終階段［1］。力竭運動致使的中樞性疲勞對大腦皮質微結構和超微結構起著損傷性的改變，其損傷后的修復可能與神經營養因子有關。神經生長因子NGF是神經營養因子家族成員之一，對神經系統發育、損傷修復及維持正常功能起著十分重要的作用，NGF的高親和力受體TrkA被公認為是NGF的功能性受體，是啟動傳遞NGF生物效應的信息物質，故NGF和TrkA兩者共同對維持損傷神經元的結構、促進神經生長和修復起著重要的作用。就目前查閱的國內外文獻，發現缺血性再灌注對NGF、TrkA表達變化的影響報道較多，而涉及到運動或運動性疲勞對NGF、TrkA的影響報道較少，僅顧麗燕等人研究報道SD大鼠長期有氧運動4周以上，腦組織NGF水平提高［2］。由于力竭運動引起的腦部缺血現象不完全類似于缺血性再灌注的缺血改變，同時疲勞產生的機制較為復雜，故本研究旨在觀察大鼠一次性力竭性游泳運動后大腦皮質結構的變化及其與NGF、TrkA表達動態變化的關系，進而探討NGF、TrkA表達的動態變化與運動性中樞疲勞的關系，為運動性中樞疲勞的產生與消除機制提供神經生物學依據，為科學系統的運動訓練提供基礎理論。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雄性SPF級的SD大鼠50只，體重200± 10g，由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供。兔抗NGF多克隆抗體(Chemicon)，兔抗TrkA多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 將SD大鼠隨機分為空白對照組(C組、n=10)和力竭運動組(E組，n=40)。其中又將力竭運動組分為一次性力竭游泳后即刻組(E1組，n= 10)、12h組(E2組，n=10)、24h組(E3組，n=10)和48h組(E4組，n=10)。C組常規喂養，E組前3天進行無負重10min適應性游泳，隨后和C組一樣常規喂養。1周后，進行一次性力竭游泳運動。

1.2.2 模型制作 一次性力竭游泳運動:采用驅趕法使大鼠一次性負重游泳至力竭，負重量為大鼠自身體重的5%，游泳池采用無色透明玻璃缸，體積150cm× 40cm×80cm，水溫32±1℃，水深60cm。每次實驗前均重新換水，并靜置12h。力竭標準:1)大鼠沉入水下無法返回水面超過10s;2)大鼠協調運動消失，在水中無方向性地亂竄，雖未達到10s亦定為力竭。

1.2.3 灌注取材 各組取出8只用于光鏡取材。分別于力竭運動后的即刻、12h、24h、48h，將大鼠按2.3 ml/kg體重腹腔注射2%的戊巴比妥鈉麻醉，待大鼠不能動彈后，灌注取材，按L.J.Pellgrino鼠腦立體定位圖譜迅速取出大腦皮質，浸泡于10%甲醛溶液中。電鏡取材各組為2只，與光鏡取材的區別在于用37℃生理鹽水200 mL灌注后，繼續用4%戊二醛灌注，按L.J.Pellgrino鼠腦立體定位圖譜迅速取出大腦皮質，浸泡于3%戊二醛固定液中。

1.2.4 光、電鏡制備 10%中性甲醛固定24h，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，在視交叉前后連續制作腦部5um冠狀切片，常規HE染色，用于光鏡觀察。3%戊二醛固定4h，0.01MPB沖洗5×3，1%鋨酸后固定1.5h，PBS沖洗5×3，丙酮梯度脫水，EPON812浸透及包埋，常規制作超薄切片鈾、鉛染色，用于日H－600IV型透射電鏡觀察。

1.2.5 免疫組化 石蠟切片經脫蠟、水化，3%H2O2甲醇抑制內源性過氧化物酶，1∶20正常山羊血清封閉非特異性的結合位點，分別滴加一抗NGF單克隆抗體(1:50)和NGFR單克隆抗體(1:50)，4℃過液;加二抗羊抗兔抗體與配抗體用PBS以1:200體積比配制，37℃孵箱中40min;加三抗SPA鏈親合素與配抗體用PBS以1:200體積比配制，37℃孵箱中30min。DABH2O2顯色液顯色，蘇木紫復染。陰性對照采用正常山羊血清替代第一抗體進行。

1.2.6 觀察與統計方法 采用Version3.0圖像采集分析系統，在相同的視野下，分別對相鄰切片的NGF、TrkA免疫反應陽性細胞的平均光密度值進行測定。數據經SPSS 17·0系統處理。計量資料數據用x±s表示，兩組間比較用t檢驗，進行統計分析。

2 結果

2.1 各組HE染色微結構觀察

各組經HE染色微結構觀察(×400)(圖略)發現，C組結構:神經元密集、排列整齊、神經元胞漿豐富、淡染、胞核居中、著色均勻為淡藍色，神經膠質細胞細胞結構完整，排列緊密，胞漿無紅染，細胞周圍間隙致密無水腫;E1組結構:神經纖維排列紊亂，多數神經元細胞染色加深，細胞間質疏松，出現空泡;E2組結構，神經元、神經膠質膠質細胞、微血管周隙均增寬、排列松散、紊亂、數量減少，神經纖維網疏松，呈海綿狀或空泡狀，神經元胞漿空泡形成，核固縮均質化;E3組結構，神經元與神經膠質細胞排列較為紊亂，神經纖維網部分呈空泡狀;神經元胞漿繼續空泡化，核固縮均質化;E4組結構，神經元胞漿空泡化現象開始減少，微血管增多，細胞周圍間隙變窄，神經纖維數量較為增加。

2.2 NGF免疫組化微結構觀察

各組經NGF免疫組化微結構觀察×400(圖略)發現:C組極少數神經細胞呈散在的陽性反應，主要是胞漿呈弱陽性;E1組陽性表達較對照組明顯上升，大部分細胞胞核、胞漿呈棕黃色，胞體較對照組大;E2組陽性表達較為明顯;E3組陽性表達最為明顯，可見大多數細胞胞核、胞漿呈棕黃色，胞體較大;E4陽性表達水平有所下降，大部分細胞主要是胞漿表達，細胞核表達較不明顯。

2.3 TrkA免疫組化微結構觀察

各組經TrkA免疫組化微結構觀察×400(圖略)發現C組陽性表達，極少數神經細胞的胞膜和胞核呈弱陽性表達;E1組陽性表達較對照組明顯上升，表達主要位于細胞膜上和膜相鄰的胞漿部位，呈棕黃色;E2組陽性表達較為明顯，胞核、胞膜、胞漿都有表達;E3組陽性表達最為明顯，可見大多數神經細胞胞膜、胞核都有表達，但胞漿少有表達;E4組陽性表達水平有所下降，表達位于胞膜、胞核上。

2.4 電鏡超微結構觀察結果

各組經電鏡觀察超微結構如下:

圖1 C組神經元和血管電鏡超微結構觀察

圖2 E1組神經元和血管電鏡超微結構觀察

圖3 E2組神經元和血管電鏡超微結構觀察

圖4 E3組神經元電鏡超微結構觀察

圖5 E4組神經元電鏡超微結構觀察

2.5 大腦皮質NGF和TrkA的陽性表達

結果顯示:力竭運動后，大腦皮質的GF和TrkA表達均增高，與對照組比較具有統計學意義(P＜0.05)。NGF和TrkA的表達在即刻后升高，12h后有所下降，其中以TrkA下降較為明顯，與即刻組比較(P＜0.05)。24hNGF和TrkA的陽性表達達到高峰，與對照組比較具有統計學意義(P＜0.01)。48h表達開始下降。

表1 一次性力竭運動后NGF和TrkA陽性表達的變化

2.6 大腦皮質NGF和TrkA的相關性表達

結果顯示:力竭運動后的即刻，大腦皮質的NGF和TrkA表達高度正相關。

表2 一次性力竭運動后NGF和TrkA陽性表達相關性的變化

3 討論

有報道認為對缺血敏感的區域是海馬、大腦皮質及小腦蒲肯野細胞，其中大腦皮質對腦缺血的耐受性最差，最易受到缺血性的損傷［3］。一次性力竭運動超越了正常運動的生理調節范圍，導致大腦皮質微循環灌流異常，引起酸中毒和自由基中毒，從而誘導運動性中樞疲勞的出現和加重。胡建鵬［4］等人的研究表明，缺血2h再灌注1d后梗死周圍區主要表現為細胞水腫，再灌注3d后神經元空暈，并出現泡沫細胞，神經元、神經膠質細胞溶解、壞死，7d后小膠質細胞增生。褚曉凡［5］等人在對局灶性腦缺血再灌注內皮細胞缺血耐受性觀察中發現，內皮細胞在缺血3h即可發生明顯的結構變化，缺血6h內皮細胞緊密連接開放，缺血12h后可發生出血性轉化。本實驗中發現，力竭運動后的即刻大腦皮質結構發生改變，12h后結構損傷明顯，24h后損傷進行性加重，光鏡觀察神經元與神經膠質細胞排列較為紊亂，神經纖維網部分呈空泡狀;神經元胞漿空泡化，核固縮均質化。電鏡觀察神經元胞體水腫，胞漿很空，線粒體嵴斷裂、溶解、呈空泡化，核糖體少，血管周圍組織嚴重出現空泡等，而48h后結構開始恢復。實驗提示，一次性力竭運動的腦部缺血與缺血性再灌注的腦部缺血存在著一定的差異性，其損傷程度較直接的缺血缺氧輕的多，而且其變化是可逆的。

NGF作為神經系統最重要的生物活性物質，在對抗缺氧、興奮性氨基酸、自由基和低血糖等方面起著保護作用，同時對中樞及周圍神經元的存活、分化、生長、再生和功能特性的表達均發揮重要作用。NGF必須與其功能性受體結合，影響某些基因轉錄及蛋白質翻譯，從而引起一系列的生物學效應。鄧昌［6］實驗研究發現，缺血性腦缺血再灌注后，腦皮質TrkA的mRNA蛋白表達在再灌注12h和24h明顯增高，NGF在再灌注24h明顯增高，分析腦缺血后神經元內NGF和TrkA的mRNA蛋白含量增多，可能有利于受損神經元的修復。同時，近年來的一些研究［7］發現無論短暫性或持續性腦缺血，均有內源性NGF表達增加。本實驗研究結果顯示，一次性力竭運動后的即刻大腦皮質結構發生早期缺血性損傷樣改變，此時，NGF和TrkA的陽性表達細胞數量較對照組呈顯著性升高，分析在力竭運動后的缺血急性期，NGF與TrkA的增加有利于啟動相應的細胞內信號傳導途徑，一方面維持細胞內Ca2+穩態;另一方面減少自由基對神經元的損傷，同時阻止神經元凋亡，及時參與到腦缺血缺氧對大腦皮質引起的損傷。萬煒［8］等的實驗研究發現，在對大鼠脊髓全橫斷后，大腦皮質TrkA和NGF表達均上調，但NGF表達增高遲于TrkA，本實驗中，大腦皮質TrkA和NGF的表達較對照組明顯升高，但TrkA的表達呈現極顯著性的升高，這與萬煒等的實驗研究較為符合，提示當神經細胞受損時需要有相當數量的TrkA表達才能有效發揮內源性NGF對神經元的保護、促進損傷神經元的存活和修復作用。

一次性力竭運動后的12小時，大腦皮質結構損傷變化明顯，表明腦組織結構的異常變化，腦的調節功能持續性下降，導致運動性中樞疲勞的堆積。此時，NGF和TrkA的陽性表達細胞數量下調，其中TrkA的表達較即刻組出現顯著性下降(P＜0.05)，具有統計學意義。施寧華［9］等人的研究發現，隨缺血再灌注時間延長(6h－3d)，TrkA的表達明顯下調，7d后明顯升高。與本實驗較相吻合，其可能機制是NGF和TrkA在細胞中的分布不同決定的，在大多數神經元中，NGF同時定位存在于胞核與胞漿兩者中，少量神經元定位于胞漿中，而TrkA主要分布于神經元胞膜上，少量在胞漿內［10］，亞細胞研究表明位于線粒體膜上［11］。大腦皮質結構形態的破壞，導致細胞膜和線粒體膜功能出現異常，膜上受體和離子通道的功能發生改變，有可能影響到了TrkA受體在細胞膜和線粒體膜上的分布和含量，而此時細胞不能及時合成以補充膜受體的消耗，造成TrkA下調。TrkA的陽性表達細胞數量下調，反過來加重了大腦皮質形態結構的破壞，兩者互為影響進一步使運動性中樞疲勞加重。

力竭運動后24h大腦皮質結構破壞進行性加重，而NGF和TrkA的陽性表達細胞數量明顯上調，較對照組表達最為顯著。分析腦缺血損傷后功能缺損的恢復在一定程度上有賴于中樞神經系統所固有的功能重組的代償能力［12］，在力竭運動后的24h，氧自由基的堆積，導致脂質膜損傷、通透性增加、各種細胞器結構破壞，進一步抑制腦部運動和感覺等中樞，出現延遲性疲勞加重現象。而24h后神經元內NGF和TrkA的高表達有可能是功能重組的代償能力的體現，通過增加氧自由基清除劑的活力來對抗自由基，拮抗興奮性氨基酸的神經毒性作用，促進神經生存環境的改善，來維持神經元的修復和存活，為下一時段疲勞的消除和大腦皮質結構的重塑打下基礎。力竭運動后的48hNGF和TrkA陽性表達有所下調，但較24h組無顯著性差異變化，分析NGF和TrkA表達維持時間延長，能進一步激活受損神經元的存活，抑制軸突變性，促進突觸重建，豐富神經網絡［13］，同時重塑大腦皮質受損神經細胞的微結構與超微結構。本實驗觀察發現運動后48h，神經元胞漿空泡化現象開始減少，微血管增多，細胞周圍間隙變窄，神經纖維數量增多明顯，線粒體腫脹消失、可清晰的見到線粒體嵴的結構、細胞膜完整，內質網較為豐富?？梢奛GF和TrkA的持續性高表達，改善了大腦皮質的結構形態，最終達到生理功能的重建。本實驗表明，大腦皮質受損后的神經元雖然不能再生，但由于力竭運動后NGF和TrkA動態表達的變化，隨著時間的延續卻出現有意義的功能恢復，同時與運動性疲勞的產生、堆積、加重、消除關系較為密切。

本實驗中，通過對力竭運動后不同時相NGF和TrkA的陽性表達相關性的分析發現，在運動后的即刻NGF和TrkA兩者的陽性表達高度相關，分析當NGF與高親和力受體TrkA結合后，NGF對神經細胞的存活和再生發揮正性神經營養作用，而在缺乏TrkA的情況下，NGF與其低親和力受體NGFRp75結合后可誘導細胞凋亡［14］因此，TrkA的表達對于NGF的神經營養作用具有決定性意義，兩者在運動后的即刻高度相關，抑制了NGF誘導細胞凋亡的作用，有可能對48h后運動性疲勞的恢復具有積極的意義。

4 結論

(1)一次性力竭運動后大腦皮質結構的損傷和重塑與NGF、TrkA動態表達具有一定的聯系性，提示NGF與TrkA參與了運動疲勞消除的神經生物學調控過程。

(2)運動后即刻NGF和TrkA表達的高度正相關，抑制NGF誘導細胞凋亡的作用，有可能對48h后運動性疲勞的消除具有積極的意義。

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Structure and NGF，TrkA Dynamic Change in Rat Cerebral Cortex after Exhaustive Exercise

YANG Peng－pai
(Chengdu Sport University，Chengdu Sichuan China 610041)

Objective:To investigate the dynamic relationship between the morphological changes of the microstructure and ultrastructural of the cerebral cortex and nerve growth factor(NGF)and TrkA receptor in the SD male rats after one－time exhaustive exercise.Methods:After a model of one－time exhaustive swimming，rats are randomly divided into control group(C group)immediately after exercise group(E1)，12h group(E2)，24h group(E3)，48h group(E4).The cerebral cortex is removed after perfusion and position.By using HE staining，uranium－lead double staining，the ultrastructural and micro－structure change of cerebral cortex are observed in light microscopy and electron microscopy.The expression of NGF and TrkA in cerebral cortex is detected depending on immunohistochemistry and image analysis.Result:Immediately after one time exhaustive exercise，the brain structure shows early cortical ischemia－like changes;NGF，TrkA expression levels are more significantly increased than that in the control group;Cerebral cortex shows apparent structural damage after 12h，but the NGF，TrkA expression levels down;compared with E1 the expression of TrkA is significant decreased;structural damage in cerebral cortex progressively increases after 24h，NGF，TrkA expression are most significantly increased after 24h;the cerebral cortex structure begins to reshape after 48h; NGF，TrkA expression levels have come down but continue to maintain a high expression.Conclusion:There is a certain dynamic association between structural damage and remodeling of cerebral cortex with NGF，TrkA expression after onetime exhaustive exercise.

cerebral cortex，exhaustive exercise，NGF，TrkA

G804.4 Document code:A Article ID:1001－9154(2011)09－0060－05

G804.4

A

1001－9154(2011)09－0060－05

成都體育學院院級課題:JY0902。

楊澎湃(1968－)，女，重慶市人，實驗師，碩士，研究方向:運動性疲勞。

2011－06－23