雞microRNA基因“seed”區(qū)4個(gè)SNPs的群體遺傳分布

摘要：采用CRS-RFLP技術(shù)研究了rs14076349、rs16681032、rs14934924和rs16681031共4個(gè)SNPs位點(diǎn)在蛋肉兼用型、蛋用型和藥用觀賞型3種經(jīng)濟(jì)類型的6個(gè)雞群的遺傳多樣性。結(jié)果表明：rs16681032 在所有雞群中未檢測(cè)到變異，rs16681031、rs14934924和rs14076349位點(diǎn)具有較高的次等位基因頻率，分別為 0.455 3、0.117 3 和0.329 6。兼用型雞與藥用觀賞型雞在rs16681031位點(diǎn)的基因頻率分布差異顯著（P<0.05）；兼用型雞與蛋用型雞在rs14934924位點(diǎn)的基因頻率分布差異極顯著（P<0.01）；rs14076349位點(diǎn)在所有經(jīng)濟(jì)類群間的基因頻率分布差異極顯著（P<0.01）。根據(jù)基因頻率信息進(jìn)行聚類分析，大致可將6個(gè)雞群分為3類，聚類結(jié)果反映出不同雞種microRNAs調(diào)控通路的差異。研究結(jié)果表明，雞種系特異性microRNA基因可能受到正選擇的影響而存在加速進(jìn)化現(xiàn)象，其“seed”區(qū)SNPs位點(diǎn)在不同雞種的經(jīng)濟(jì)表型的形成中可能發(fā)揮著重要作用。

關(guān)鍵詞：雞；MicroRNA；seed；單核苷酸多態(tài)；遺傳變異

中圖分類號(hào)：S831.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.026

Research on Population Genetics Variation of Four SNPs Localted in the Seed Regions of Chicken-specfic MicroRNAs

GENG Li-ying1，ZHANG Chuan-sheng1，YIN Chun-guang2，CAO Ding-guo3，F(xiàn)U Zhi-xin1 ，LIU Zheng-zhu1

( 1. Hebei Normal University， Changli， Hebei 066600，China;2.Jining College， Jining， Shandong 273155，China;3.Institute of Poultry Science of Shandong Academy of Agricultural Science， Jinan， Shandong250023，China)

Abstract：To investigate the evolution pattern of chicken-specific microRNAs and the genetic distribution difference of SNPs located in seed regions among three economic groups of chicken. Genetic diversity of rs14076349， rs16681032 ，rs16681031 and rs14934924 among six chicken populations which belong to egg meat dual purpose， egg type and medicinal and ornamental chickens were determined using created restriction site PCR-RFLP method. The results showed that no variation was detected in rs16681031 sites in six chicken populations. The rs16681031， rs14934924 and rs14076349 also showed a greater minor allele frequency. The results also showed that an extreme significant differences in the frequency of the rs14076349 site among three economic groups of chicken (P<0.01). Egg meat dual purpose chickens had significant differences in the frequency of the rs16681031 (P<0.05)and medicinal and ornamental chickens. Egg type chickens had an extreme significant differences in the frequency of the rs14934924 (P<0.01)and egg meat dual purpose chickens. The dendrograms based on allele frequency divided the six chicken populations into three clusters ，which reflected the difference of regulatory pathway of microRNAs in six chicken populations. The results suggested that positive selection and evolutionary acceleration has occurred in the seed regions of chicken-specfic microRNAs during chicken evolution.And these SNPs located in the seed regions of chicken-specfic microRNAs may play an important role in the formation of economic phenotype of different chicken breeds .

Key words: chicken; microRNA; seed; SNP; genetic variation

分子RNA，通過(guò)與靶基因mRNA結(jié)合，使其降解或翻譯阻遏，從而參與個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病發(fā)生過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控[1-3]。眾多研究表明，microRNA 基因“seed”區(qū)（5/ 第2～8堿基）是其調(diào)控功能的一個(gè)重要區(qū)域，與其加工成熟、靶基因選擇和調(diào)控效率密切相關(guān)[4-6]。該區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中往往受到較大的選擇壓力，而表現(xiàn)較低水平的SNP多樣性[9-10]。但近期研究發(fā)現(xiàn)，人種系特異的microRNA基因卻由于受到正選擇的影響，其“seed”區(qū)具有高水平的SNP多樣性，并且這些SNPs位點(diǎn)還具有較高的次等位基因頻率，據(jù)推測(cè)這可能與人類特異表型的形成有關(guān)[11]。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)雞種系特異的microRNA基因“seed”區(qū)也具有高水平的SNP多樣性[12]，但這些SNPs位點(diǎn)的群體次等位基因頻率如何，尚未可知。此外，我們推測(cè)，如果這些變異位點(diǎn)與家雞經(jīng)濟(jì)表型相關(guān)，那么其在不同經(jīng)濟(jì)類型雞群間的遺傳分布可能存在差異。

為此，本研究選擇雞種系特異的microRNA基因“seed”區(qū)的4個(gè)SNPs位點(diǎn)為研究對(duì)象，采用引入酶切位點(diǎn)的RFLP技術(shù)，檢測(cè)蛋肉兼用型雞種的濟(jì)寧百日雞、瑯琊雞、汶上蘆花雞、北京油雞，藥用觀賞型的絲羽烏骨雞和蛋用型的來(lái)航雞共6個(gè)群體的179個(gè)個(gè)體的基因型，研究上述位點(diǎn)的基因頻率及其在不同經(jīng)濟(jì)類型雞種間的遺傳分布差異，為雞microRNA基因的進(jìn)化模式和家雞經(jīng)濟(jì)表型多樣性的分子機(jī)制研究提供參考信息。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

以蛋肉兼用型雞種：濟(jì)寧百日雞（Jiningbairi，JB）、瑯琊雞（Langya，LY）、汶上蘆花雞（Wenshangluhu，WL）和北京油雞（Beijingyou chicken，BY）；藥用觀賞型：絲羽烏骨雞（Siyuwugu，WG）；蛋用型：來(lái)航雞（Leghorn Chicken，LH），共6個(gè)品種179只個(gè)體為試驗(yàn)材料。各地方雞種均采自原產(chǎn)地保種場(chǎng)。來(lái)航雞采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)雞群。翅靜脈采血，用常規(guī)的苯酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，DNA樣品被稀釋成75 ng·L-1用于PCR擴(kuò)增及基因型分型。

1.2基因型檢測(cè)

根據(jù)Sanger數(shù)據(jù)庫(kù)公布的microRNA染色體定位信息，利用http://www.ensembl.org/網(wǎng)頁(yè)界面在線工具，獲取基因序列。利用http://bioinfo.bsd.uchicago.edu/SNP_cutter.htm在線工具，引入1~2個(gè)突變堿基，選擇合適的限制性酶切位點(diǎn)，結(jié)合Primers 3.0軟件輔助設(shè)計(jì)引物。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列及其相關(guān)擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。經(jīng)驗(yàn)證此引物的特異性很好，可進(jìn)行批量擴(kuò)增。

PCR 擴(kuò)增體系為25 μL，其中模板DNA 100 ng ，10 ×Buffer 2.5 μL ，dNTPs 200 pmol·L-1，DNA Taq 酶1 U，上下游引物各10 pmol ，MgCl2 1.5 mmol·L-1，加雙蒸水至25 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min ，94 ℃ 30 s ，不同基因復(fù)性溫度具體見(jiàn)表2，復(fù)性時(shí)間30 s ，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，37 ℃反應(yīng)過(guò)夜；酶切產(chǎn)物用3.5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。限制性內(nèi)切酶等試劑購(gòu)自寶生物大連工程有限公司。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

利用PopGene32（ver1.31）軟件統(tǒng)計(jì)已檢測(cè)到的SNP在每個(gè)家雞群體內(nèi)的等位基因頻率、有效等位基因數(shù)（Ne）、群體雜合度（H）和Shannon's信息指數(shù)等群體遺傳參數(shù)。不同經(jīng)濟(jì)類型雞群的基因分布差異采用Fish/er檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1基因型和等位基因頻率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

rs16681032位點(diǎn)未檢測(cè)到變異，其余3個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。rs16681031、 rs14934924和rs14076349 次等位基因頻率分別為：0.455 3、0.117 3 和 0.329 6。

用卡方檢驗(yàn)和最大似然率法分別對(duì)各雞群體內(nèi)3個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行服從Hardy-Weinberg平衡的檢驗(yàn)，結(jié)果rs16681031、rs14934924

在所有供試家雞群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。rs14076349 位點(diǎn)在濟(jì)寧百日雞（P＜0.01）和瑯琊雞（P＜0.05）顯著偏離Handy-Weinberg平衡。卡方檢驗(yàn)和最大似然率法的檢驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.2 不同經(jīng)濟(jì)類型雞群間基因頻率分布檢測(cè)

由表3可見(jiàn)，兼用型雞與藥用觀賞型雞在rs16681031位點(diǎn)的基因頻率分布差異顯著（P<0.05），與蛋用型雞在rs14934924位點(diǎn)的基因頻率分布差異極顯著（P<0.01）；rs14076349位點(diǎn)在所有經(jīng)濟(jì)類群間的基因頻率分布差異極顯著（P<0.01）。

2.3 3個(gè) SNP位點(diǎn)不同雞群群體內(nèi)的遺傳變異及中性選擇分析

由表4可見(jiàn)，在供試的6個(gè)雞群體的3個(gè)SNPs位點(diǎn)中，rs16681031位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（Ne）、群體雜合度（H）和Shannon's信息指數(shù)（I）都較高，而rs14934924位點(diǎn)這幾個(gè)指標(biāo)則相對(duì)較低。3個(gè)位點(diǎn)在幾乎所有群體的固定指數(shù)均為負(fù)值，根據(jù)中性理論進(jìn)行樣本含量為1 000的模擬群體的遺傳變異預(yù)測(cè)結(jié)果為觀察值與預(yù)測(cè)值間存在顯著水平的變異（P<0.05）。

2.4 基于microRNA SNP位點(diǎn)等位基因頻率的聚類分析

基于3個(gè)microRNA 基因SNP位點(diǎn)等位基因頻率計(jì)算6個(gè)雞種群體的Nei遺傳距離（表5），并在此基礎(chǔ)上用UPGMA法構(gòu)建6個(gè)雞群間的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖1）。由圖1可知，6個(gè)雞種分為3類：第一類包括絲羽烏骨雞、濟(jì)寧百日雞、瑯琊雞和來(lái)航雞；第二類包括北京油雞；第三類包括汶上蘆花雞。

3討論

本研究中，筆者以蛋用型、觀賞藥用型和肉蛋兼用型共3種經(jīng)濟(jì)類型的6個(gè)品種179個(gè)個(gè)體為試驗(yàn)材料，通過(guò)在引物序列3′ 端引入堿基錯(cuò)配，與突變堿基形成相應(yīng)酶切位點(diǎn)，采用RFLP技術(shù)檢測(cè)了Gga-mir-1644（rs14076349）、Gga-mir-1658*（rs16681031 、rs16681032）和Gga-mir-1657（rs14934924）的“seed”區(qū)4個(gè)SNPs位點(diǎn)的群體突變。研究發(fā)現(xiàn)，rs16681031、 rs14934924和rs14076349三個(gè)位點(diǎn)具有較高的次等位基因頻率，分別為0.455 3、0.117 3 和 0.329 6。這一結(jié)果同Zhang等[11]對(duì)人的種系特異性microRNA基因“seed”區(qū)SNPs位點(diǎn)研究結(jié)果是一致的， 即種系特異性microRNA基因“seed”區(qū)的SNPs位點(diǎn)具有較高的次等位基因頻率。從選擇的角度看， microRNA基因作為一種重要的調(diào)節(jié)基因，其“seed”區(qū)DNA的多樣性是一種功能調(diào)控性多態(tài)， 可以通過(guò)改變對(duì)靶基因的選擇或調(diào)控效率，進(jìn)而影響數(shù)以百計(jì)的基因的表達(dá)，因此“seed”區(qū)在物種演化和發(fā)生過(guò)程中承受著比其它區(qū)域更大的選擇壓， 其中種系特異性microRNA基因“seed”區(qū)可能受到正選擇的影響，而存在加速進(jìn)化現(xiàn)象，而物種間保守性microRNA基因的多受到凈化選擇的壓力[7，9-11]。基于此， 筆者推測(cè)雞種系特異性microRNA基因“seed”區(qū)較高的SNP多樣性和次等位基因頻率是對(duì)正選擇壓力的一種適應(yīng)性的表現(xiàn)，這些SNPs變異可能與進(jìn)化過(guò)程中家雞表型多樣性的形成密切相關(guān)。顯著性檢驗(yàn)也表明， 兼用型雞與藥用觀賞型雞在rs16681031位點(diǎn)的基因頻率分布差異顯著（P<0.05），與蛋用型雞在rs14934924位點(diǎn)的基因頻率分布差異極顯著（P<0.01）；rs14076349位點(diǎn)在所有經(jīng)濟(jì)類群間的基因頻率分布差異極顯著（P<0.01）。這一結(jié)果除了與microRNA基因“seed”區(qū)承受的選擇壓有關(guān)外， 還可能同持續(xù)的高強(qiáng)度的人工選擇緊密關(guān)聯(lián)。分子進(jìn)化的中性理論認(rèn)為自然群體中分子水平上的遺傳變異在很大程度上是中性的，各種變異的存在與否完全取決于遺傳漂變和凈化選擇的作用。針對(duì)某一試驗(yàn)遺傳變異情況的進(jìn)化進(jìn)行中性選擇分析時(shí)，應(yīng)先計(jì)算各群體在該基因座位上雜合度的觀察值，再根據(jù)中性理論進(jìn)行樣本含量為1000的模擬群體的遺傳變異預(yù)測(cè)。本研究（表4）觀察值與預(yù)測(cè)值間存在顯著水平的變異（P<0.05），表明Gga-mir-1644（rs14076349）、Gga-mir-1658*（rs16681031 、rs16681032）和Gga-mir-1657（rs14934924）基因在進(jìn)化過(guò)程中并不遵循中性選擇模式。這一結(jié)果表明，上述SNPs位點(diǎn)可能受到人工選擇和自然選擇的雙重影響。

本研究基于等位基因的分布頻率將6個(gè)雞種聚為三類：第一類包括絲羽烏骨雞、濟(jì)寧百日雞、瑯琊雞和來(lái)航雞；第二類包括北京油雞；第三類包括汶上蘆花雞。這一聚類結(jié)果既與各雞種的地理分布不一致，也與其經(jīng)濟(jì)類型和外貌特征不相符[14]。由于microRNA是一類重要的調(diào)控基因，推測(cè)這一聚類結(jié)果可能僅反映出不同雞種間microRNA調(diào)控通路的差異。關(guān)于這一聚類結(jié)果究竟反映出哪種調(diào)控通路的差異，究竟對(duì)雞何種經(jīng)濟(jì)表型產(chǎn)生影響還有待進(jìn)一步研究。鑒于microRNA“seed”區(qū)SNPs可能對(duì)其表達(dá)和調(diào)控功能產(chǎn)生重要影響。因此，這一聚類結(jié)果在一定程度上反映出家雞在microRNA的調(diào)控通路上的品種特異性。

本研究中，rs16681032位點(diǎn)在6個(gè)群體均未檢測(cè)到變異，可能的原因主要有：一是該位點(diǎn)是由絲羽烏骨雞與紅原雞基因組序列比對(duì)鑒定，可能存在一定的誤差；二是本研究所檢測(cè)的樣本量偏小；三是還可能由紅原雞向其它雞種分化過(guò)程中，該SNP位點(diǎn)丟失所致。

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