鯉細(xì)菌性敗血癥的免疫研究

摘要：選取分離于鯉細(xì)菌性敗血癥病例的嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒力菌株進(jìn)行復(fù)壯，于菌懸液中加入0.2% 甲醛于28 ℃ 滅活12 h制成滅活疫苗，對(duì)鯉進(jìn)行免疫接種后，通過(guò)檢測(cè)抗體， 以確定魚(yú)體對(duì)疫苗的應(yīng)答強(qiáng)度。分別取注射免疫后第21，28，35，42天的血清做凝集試驗(yàn)，并于首免6周后做人工感染保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果抗體最高效價(jià)達(dá)到 212，而對(duì)照組為0。受免組攻毒免疫保護(hù)率達(dá)90%，表明魚(yú)體對(duì)嗜水氣單胞菌滅活疫苗可以產(chǎn)生免疫應(yīng)答， 對(duì)鯉有一定的免疫保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌性敗血癥；鯉；免疫

中圖分類(lèi)號(hào)：S941.42+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.027

Immunological Study of Bacterial Septicemia in Carp

ZHANG Yu-fen1，2， ZHANG Wen-li1，LI Xu-kun1，YANG Sen1， ZHANG Xiu-jun1

(1.Fengrun Center of Disease Control and Prevention ，Tangshan， Hebei 064000， China; 2.Department of Life Science， North China Coal Medical College， Tangshan， Hebei 063000， China)

Abstract：Bacterial liquid were obtained after rejuvenating from selected strong virulence strains ofAeromonas hydrophila isolated from bacterial septicemia of carp， which was made into vaccine by inactivating it with 0.2% formaldehyde at 28 ℃ for 12 hours. The inactivated vaccine was inculated carps through abdominal cavity. The intensity of response in fish to stimulation of vaccine was determined through examine immune antibody. Examination of the agglutinating antibody titers on the 21th ， 28th ， 35th ， 42th days after vaccination showed that the highest titer of the immunized carp was 212， while that of the control was 0， antibody levels were significatly different between immunized group and control group(P<0.05). The relative percent survival of the immuned group was 90% by experiments about protection to artificial infections by immuned six weeks later. The resuls showed that fish which was immuned could create 9 times immune antibody response to immune of inactivated vaccine of Aeromonas hydrophila， had a certain protective effective effect on Carp.

Key words: bacterial septicemia；carp；immune

細(xì)菌性敗血病(bacterial septicemia)20世紀(jì)70年代始發(fā)于日本，80年代在中國(guó)臺(tái)灣流行，1989 年傳入中國(guó)大陸[1]。自 1989 年以來(lái)，各種淡水魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性敗血病頻繁發(fā)生[2-6]。嗜水氣單胞菌為本病的主要病原菌，廣泛分布于池塘、溪、澗、江、河、湖泊和鄰泊河口等淡水環(huán)境，因此感染范圍也十分廣泛。目前，越來(lái)越多的水產(chǎn)學(xué)專(zhuān)家研究疫苗用于防治魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性敗血癥。為探討疫苗的防治效果，筆者采用自然患細(xì)菌性敗血癥的鯉 (Cyprinus Carpio Linnaeus) 中分離出強(qiáng)毒株，制成滅活菌苗，以注射方式進(jìn)行免疫接種，用凝集試驗(yàn)檢測(cè)了免疫后鯉體內(nèi)的血清抗體水平，并進(jìn)行了攻毒保護(hù)試驗(yàn)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)菌株，自患細(xì)菌性敗血病的鯉體內(nèi)分離，本實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物供試鯉，購(gòu)自唐山某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.3培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂由杭州天和微生物試劑有限公司提供；甲醛由信陽(yáng)市化學(xué)試劑廠(chǎng)提供；96孔板購(gòu)自美國(guó)Costar公司。

1.2 方法

1.2.1菌株的復(fù)壯及 LD50 的測(cè)定保存嗜水氣單胞菌菌株活化后，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯 28℃ 搖床培養(yǎng) 24 h，取菌體濃度約為 2.5×109 cfu·mL-1 的培養(yǎng)物 0.5 mL 腹腔注射鯉 3 條，于水族箱中飼養(yǎng)觀察發(fā)病情況。無(wú)菌條件下解剖瀕死鯉，平板劃線(xiàn)離單菌落，進(jìn)行鑒定，并以此菌株作為生產(chǎn)菌種。

將試驗(yàn)魚(yú)分成4組，每組4尾，將濃度為 2.5×109 cfu·mL-1 的復(fù)壯后的菌液以 10-1，10-2，

10-3，10-4 倍比稀釋?zhuān)肯♂尪染焊骨蛔⑸漉?0.5 mL，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照。試驗(yàn)魚(yú)養(yǎng)于塑料缸內(nèi)，充氣，定期清污換水。認(rèn)真觀察記錄 7 d 內(nèi)試驗(yàn)魚(yú)的發(fā)病及死亡情況，參考 Reed-Muench 法計(jì)算半數(shù)致死量 (LD50) 。

1.2.2疫苗的制備將菌種接種到加有 1% 胰蛋白胨、pH 為7.5的普通肉湯中，180 r·min-1、28 ℃ 搖床培養(yǎng) 18 h 后，加 0.2% 甲醛，28℃ 培養(yǎng) 12 h，制得嗜水氣單胞菌的滅活疫苗，采用常規(guī)方法進(jìn)行無(wú)菌檢查，再用嗜水氣單胞菌全菌苗雙倍濃度腹腔注射6尾鯉進(jìn)行安全檢驗(yàn)。

1.2.3鯉免疫方案隨機(jī)抽取150~200 g的健康魚(yú)140條，暫養(yǎng)2周后分為2組，1組為注射組，2組為對(duì)照組。其中，注射組為腹腔注射 0.2 mL濃度為 3×108 cfu·mL-1的和完全佐劑混合的滅活疫苗，兩周后，進(jìn)行二次免疫。二次免疫時(shí)注射 0.2 L濃度為 3×108 cfu·mL-1的滅活疫苗。對(duì)照組為腹腔注射 0.2 L生理鹽水。

1.2.4血清的采集健康魚(yú)二次免疫后，每隔7 d各組魚(yú)中隨機(jī)取4條，注射器尾靜脈穿刺采血，以8 089 r·min-1、4℃ 離心 15 min，分離血清備用。

1.2.5血清抗體效價(jià)的檢測(cè)將嗜水氣單胞菌培養(yǎng)液12 000 r·min-1 離心后用等量生理鹽水重懸，將菌懸液置于 37 ℃條件下水浴加溫0.5 h；將待檢血清在96孔微量滴定板上依次梯度稀釋?zhuān)詈?個(gè)孔為生理鹽水對(duì)照孔；用微量移液器于第1孔中加入80 μL生理鹽水，其余各孔加 50 μL ；向第1個(gè)孔中加入20 μL 的抗血清，吹吸混勻后取 50 μL 加入第2孔，再混勻后從第 2 孔取 50 μL 加入第3孔，依此類(lèi)推至倒數(shù)第2孔，棄去50 μL，最后1孔作為對(duì)照孔；向每個(gè)孔中加入50 μL嗜水氣單胞菌懸液，吹吸混勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中1 h，放置在4 ℃條件下過(guò)夜，觀察結(jié)果。

1.2.6攻毒保護(hù)試驗(yàn)在首次免疫后第6周，以L(fǎng)D50 嗜水氣單胞菌攻擊各免疫組魚(yú)，同樣環(huán)境養(yǎng)殖7 d，觀察死亡魚(yú)數(shù)，計(jì)算各組魚(yú)的相對(duì)存活率。

相對(duì)存活率(RPS)=×100%

1.2.7田間試驗(yàn)在陡河水庫(kù)某養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，按實(shí)驗(yàn)室免疫程序注射疫苗，記錄細(xì)菌性敗血癥流行季節(jié)鯉的發(fā)病、死亡情況。試驗(yàn)中投餌、施肥、排水按魚(yú)場(chǎng)規(guī)定統(tǒng)一管理。

1.2.8統(tǒng)計(jì)方法 采用 SPSS 13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 時(shí)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1菌株復(fù)壯的結(jié)果

受試鯉全部死亡，主要癥狀為兩眼突出，腹部膨大，魚(yú)體兩側(cè)及腹側(cè)充血發(fā)紅，少數(shù)病變嚴(yán)重的鯉用手觸摸體表，鱗片即脫落。剖檢病魚(yú)：肝臟蒼白，質(zhì)地脆弱，膽囊高度充盈，脾臟呈暗黑色，腹腔有大量淡紅色腹水。

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上為單一純菌落，特征為無(wú)色，半透明，圓形，表面光滑，濕潤(rùn)，邊緣整齊，無(wú)水溶性色素，經(jīng)鑒定為嗜水氣單胞菌。

根據(jù)鯉的死亡情況，由Reed-Muench 法計(jì)算出其LD50 為2.5×107 cfu·mL-1。

2.2疫苗安全性實(shí)驗(yàn)

將制備好的疫苗進(jìn)行無(wú)菌檢查，無(wú)任何菌落生長(zhǎng)，也無(wú)溶血環(huán)產(chǎn)生。將疫苗腹腔注射(0.2 mL·尾-1)健康鯉，7 d 內(nèi)全部存活，且未見(jiàn)異常反應(yīng)，顯示疫苗的安全性良好。

2.3 血清凝集抗體效價(jià)的測(cè)定

由圖1可知，鯉在經(jīng)注射免疫后，于第 35 天凝集效價(jià)達(dá)到高峰，之后開(kāi)始下降。免疫組血清中的凝集抗體效價(jià)與對(duì)照組的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4實(shí)驗(yàn)室攻毒保護(hù)試驗(yàn)

由表1可知，在注射免疫試驗(yàn)組中，鯉累計(jì)死亡3條，存活率為 90.0%，免疫保護(hù)率為 90.0%。在對(duì)照組中，鯉全部死亡，存活率為0。根據(jù)各組鯉存活率的分析，發(fā)現(xiàn)免疫組的攻毒保護(hù)效應(yīng)與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5田間攻毒保護(hù)試驗(yàn)

由表2可知，在注射免疫試驗(yàn)組中，鯉的存活率為78.0%，在對(duì)照組中，鯉的存活率為18.0%。兩組鯉攻毒保護(hù)效應(yīng)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

（1）本試驗(yàn)所用的嗜水氣單胞菌菌株為從患病魚(yú)提取，其半數(shù)致死量為 2.5×107 cfu·mL-1，毒力較強(qiáng)。

（2）采集鯉的血液，檢測(cè)血清中的抗體水平，結(jié)果表明，鯉在免疫21~42 d內(nèi)均能檢測(cè)到抗體，而對(duì)照組抗體效價(jià)為0。說(shuō)明采用甲醛滅活所制疫苗能使鯉產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可起到了很好的保護(hù)作用。

（3）實(shí)驗(yàn)室攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)受免魚(yú)的免疫保護(hù)率達(dá)90%，與他人試驗(yàn)結(jié)果相比[7-13]，此疫苗效果尚可。

（4）田間攻毒試驗(yàn)中受免組免疫保護(hù)率為78%，而對(duì)照組為18%，和實(shí)驗(yàn)室攻毒試驗(yàn)結(jié)果相比有些差別，出現(xiàn)這一試驗(yàn)結(jié)果可能有以下幾方面的原因：實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)魚(yú)的樣本量較小，對(duì)結(jié)果有一定的影響;受免魚(yú)在進(jìn)行免疫時(shí)，可能造成人為的損傷，如捕撈、工作人員不同的注射方式等，導(dǎo)致試驗(yàn)魚(yú)的死亡；試驗(yàn)魚(yú)在漁場(chǎng)養(yǎng)殖時(shí)，工作人員所投喂的飼料中添加了某些抗感染藥物，使對(duì)照組的免疫保護(hù)率提高。

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