利用分子標(biāo)記輔助選擇選育抗白葉枯病恢復(fù)系

摘要：利用水稻恢復(fù)系C418與攜帶Xa21基因親本回交轉(zhuǎn)育的中間材料，通過分子標(biāo)記輔助選擇，結(jié)合人工接種鑒定，農(nóng)藝性狀考察和田間配合力測定，選育出一批攜帶Xa21基因、白葉枯病抗性顯著提高、農(nóng)藝性狀優(yōu)良、配合力較強(qiáng)的新恢復(fù)系，同時篩選出一批優(yōu)勢雜交組合，為雜交稻抗病育種奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：分子標(biāo)記輔助選擇；水稻白葉枯病；恢復(fù)系；抗性；基因；選育

中圖分類號：S435.121.4+8文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.011

Breeding Restorer Lines with Resistance to Bacterial Blight by Using Molecular Marker Assisted Selection

LI Yan-ping， SUN Hai-bo， ZOU Mei-zhi， WANG Jing-yu， LIU Jian

(Japonica Hybrid Research Center of Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300112， China)

Abstract：By using the generations derived from restorer line C418 backcrossing with parent-Xa21 gene， through molecular marker assisted selection， inoculating representative strains， examining agronomic characters， testing combing ability， a series new restorer lines with Xa21 were bred. Comparatively with C418， these new restorer lines had higher resistance to bacterial blight， better agronomic characters， better combing ability， some newhybrid combinations with high quality were bred also， they would lay a matter foundation for hybrid resistant breeding.

Key words: molecular marker assisted selection; bacterial blight of rice; restorer line; resistance; gene; breed

由水稻黃單胞桿菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae， Xoo）引起的細(xì)菌性病害水稻白葉枯病，是水稻尤其是雜交稻生產(chǎn)中的重要病害之一，罹病稻株葉片枯萎，影響光合作用，千粒質(zhì)量降低，一般減產(chǎn)20%~30%，嚴(yán)重的可減產(chǎn)80%，甚至絕收。利用寄主抗性，培育抗病品種是從根本上控制白葉枯病的有效措施[1-3]。源于非洲的長藥野生稻（Oryza longistaminata L.）Xa21基因是對水稻白葉枯病具有廣譜抗性的顯性抗性基因[4]。Xa21基因的克隆和廣泛應(yīng)用為培育高抗白葉枯病水稻品種提供了寶貴材料[5]。用分子標(biāo)記輔助選擇可實(shí)現(xiàn)直接針對基因型的選擇，選擇效率較高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，也可進(jìn)行早世代選擇[5]。本研究利用水稻恢復(fù)系C418與攜帶Xa21基因親本回交轉(zhuǎn)育的中間材料，通過分子標(biāo)記輔助選擇，結(jié)合人工接種鑒定，農(nóng)藝性狀考察和田間配合力測定，快速選育出一批攜帶Xa21基因、白葉枯病抗性明顯提高、農(nóng)藝性狀優(yōu)良、配合力較強(qiáng)的新恢復(fù)系，同時篩選出一批優(yōu)勢雜交組合，為雜交稻抗病育種奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

由水稻恢復(fù)系C418與攜帶Xa21基因親本回交轉(zhuǎn)育而來的中間材料：08T-19~08T-34共計(jì)16個， 09T-235~09T-259共計(jì)25個；水稻不育系341A和16A及其與新種質(zhì)恢復(fù)系配制的雜交組合；對照品種C418、津原45。

1.2方法

1.2.1常規(guī)種植方法分別于2008年和2009年正季在天津市農(nóng)作物研究所、冬季在海南試驗(yàn)地進(jìn)行加代繁殖，配制測恢雜交組合。天津4月中旬播種，每份播20 g；5月下旬插秧，每份材料插單本40株。田間調(diào)查生育期、長勢長相、整齊度、抗逆性等；室內(nèi)取5株考察株高、穗數(shù)、穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒質(zhì)量、谷草比及理論產(chǎn)量等。

1.2.2分子檢測方法(1)DNA提取方法。取約300 mg新鮮的水稻嫩葉用液氮速凍后研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至1.5 mL Enpdoff管中；加入650 μL經(jīng)65 ℃預(yù)熱的SDS抽提緩沖液， 65 ℃水浴40min，每隔10 min搖動混勻；加入等體積的氯仿異戊醇混合液，搖動混勻3 min，靜置3 min；

10000 r·min-1離心8 min，小心轉(zhuǎn)移上清于另一潔凈的1.5 mL離心管中；加入0.8倍體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置片刻出現(xiàn)白色絮狀沉淀；10 000 r·min-1離心5 min，棄上清收集沉淀；加入800 uL75%的乙醇洗滌沉淀；12 000 r·min-1離心3 min后棄上清；超凈臺上吹干沉淀后加入200 μL TE（pH8.0）溶解備用。

（2）PCR反應(yīng)體系（總體積20 μL）。 模板: DNA 10~30 ng；10×Baffer（含20 mmoL·L-1 Mg2+）2 μL；dNTP（2.5 mmoL·L-1）0.2 μmoL·L-1；primer1 0.2 μmoL·L-1；primer20.2 μmoL·L-1；Taq酶 1U；ddH2O補(bǔ)至20 uL（負(fù)對照的模板為2 μL的雙蒸水）。

（3）反應(yīng)程序。94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行30個循環(huán)，然后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像儀照相。

（4）Xa21基因連鎖標(biāo)記序列及片斷大小。F 5′-ATTGAATAATTCACTGGGTATTGG-3′，R 5′-GTCTTGCCTTGCACTTCTGCACGA-3′片段大小為1.5 Kb。

1.2.3人工接種鑒定方法 （1）病菌來源與制備。白葉枯菌“浙173”為強(qiáng)致病菌株由江蘇農(nóng)科院植保所提供。病原菌菌株在Wakimoto培養(yǎng)基上于26 ℃下活化24 h，移至液體培養(yǎng)基搖床振蕩培養(yǎng)48 h后，菌液濃度配置為3×109 cfu·mL-1的懸浮液。

（2）接種方法。在植株5葉期和孕穗期分別用上述菌懸液剪葉接種，用剪刀蘸菌液后再剪葉尖0.5 cm處。

（3）調(diào)查時間。接種后21 d，調(diào)查測量病斑長度和葉片總長度，計(jì)算病斑占葉面積的百分比和平均值。

2結(jié)果與分析

2.12008年C418轉(zhuǎn)育后代分子檢測及抗病鑒定結(jié)果

2.1.12008年分子檢測結(jié)果檢測16個材料，編號為08T-19~08T-34，其中08T-34為陰性對照C418；8T-19，20，21為C418轉(zhuǎn)育后代與不育系所配雜交稻的3個F2分離群體；08T-22為轉(zhuǎn)入Xa4/Xa21的蜀恢527株系；08T-24，25，26，27，28為轉(zhuǎn)入其他抗白葉枯病基因的中間材料；08T-23，29，30，31，32，33為轉(zhuǎn)入Xa21基因的6個C418后代。

從圖1中看出，與Marker比對，在1.5 Kb位置擴(kuò)增出片斷的有23、29、30、31、32和33，它們分別是08T-23、08T-29、08T-30、08T-31、08T-32和08T-33，這6個正是由C418與攜帶Xa21基因的親本回交轉(zhuǎn)育的后代株系，說明均攜有Xa21基因；而對照C418和其他材料沒有擴(kuò)增出片段，說明被檢測者沒有Xa21基因，F(xiàn)2材料尚在分離階段。

2.1.22008年抗病鑒定結(jié)果

本次鑒定材料共計(jì)12個，從表1可以看出，在分蘗期沒有表現(xiàn)出抗病性；在孕穗期有2個R，分別是08T-21和08T-30，有3個MR，分別是08T-29，32，33。

檢測結(jié)果與抗病鑒定結(jié)果結(jié)合看，6個恢復(fù)系后代株系中有4個材料既有Xa21基因又表現(xiàn)出不同程度的抗病水平，它們是08T-29，30，32，33；有2個材料08T-23、31攜有Xa21基因但沒有表現(xiàn)出抗性來；而F2代08T-21抗病性較好也沒有擴(kuò)增出目的片斷。以上結(jié)果說明各個材料在株系內(nèi)仍存在分離，因?yàn)闄z測與鑒定不是取自一株。

2.22009年C418轉(zhuǎn)育后代分子檢測及抗病鑒定結(jié)果

為了盡快選育出純合穩(wěn)定的抗病材料， 2008年對既有抗病基因又表現(xiàn)抗病性的2個株系進(jìn)行了優(yōu)異單株選擇，2009年利用這些單株形成的株系進(jìn)行了進(jìn)一步分子檢測和抗病鑒定。共計(jì)25個材料，編號為09T-235~09T-259，分別來自08T-29（10個）、08T-30（15個）。

2.2.12009年分子檢測結(jié)果 從表2看出，25個株系只有2個為陰性，表明來自08T-29的這2個株系不含有Xa21基因，其余23個株系均含有Xa21基因。同抗病鑒定結(jié)果比對，表明部分株系抗病性還沒有完全穩(wěn)定。

從兩年的檢測結(jié)果看，08T-30的后代抗病基因已經(jīng)純合穩(wěn)定，可以直接加以利用；而08T-29的后代還有部分分離，應(yīng)該繼續(xù)加代檢測。

2.2.2 2009年抗病鑒定結(jié)果 從表3中看出，25個株系在分蘗期表現(xiàn)高抗2個、抗7個、中抗14個；在孕穗期表現(xiàn)抗3個、中抗15個；兩個時期表現(xiàn)中抗及以上者有17個材料：09T-236、239、240、242、243、244、245、247、249、250、252、254、255、256、257、258、259，最突出的是09T-249和09T-254，二者抗病水平均為高抗和抗，而表現(xiàn)最差的是09T-253，兩個時期分別表現(xiàn)高感和感。

分子檢測與抗病鑒定結(jié)合來看，雖然株系間抗病性表現(xiàn)存在差異，但25個株系有24個既有抗病基因又表現(xiàn)一定抗病性，并且在分蘗期和孕穗期均表現(xiàn)抗性的有17個株系，有2個達(dá)到高抗，說明轉(zhuǎn)入Xa21基因的恢復(fù)系后代抗病性顯著提高。

2.3C418轉(zhuǎn)育后代農(nóng)藝性狀考察

2.3.12008年考察結(jié)果 從田間調(diào)查結(jié)果看，后代株系長勢整齊一致，活性好于對照C418。從考種結(jié)果看，轉(zhuǎn)入抗性基因后代株高、穗長均超過對照；穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒質(zhì)量材料間差異較大；而谷草比差異較小；最穩(wěn)定的是芒，均為無芒。從理論產(chǎn)量看，有2個材料超過對照，分別是08T-23和08T-33。

2.3.2 2009年考察結(jié)果 從表6看出，株系間最穩(wěn)定的仍然是芒，都為無芒；比較穩(wěn)定的是千粒質(zhì)量，大部分在25 g左右，只有09T-249比較出眾，達(dá)到29.7 g。從株高、穗長、穗數(shù)看，差異也比較小，穗粒數(shù)、單株谷質(zhì)量差異較大。

2.3.3抗白葉枯病穩(wěn)定株系選育小結(jié)通過田間農(nóng)藝性狀考察、室內(nèi)考種、人工接種鑒定及分子檢測，利用2年時間選育出田間生長整齊一致、結(jié)實(shí)率比較高、后期活性較好、既具有目的基因（Xa21）又對白葉枯病達(dá)中抗以上水平的穩(wěn)定株系22個；其中17個株系在分蘗期和孕穗期均表現(xiàn)中抗以上；最突出的是09T-249、254，達(dá)到高抗水平。

2.4抗病穩(wěn)定株系測恢結(jié)果

從表7的田間表現(xiàn)看：6個測優(yōu)組合田間長勢整齊一致，植株高大健壯，豐產(chǎn)性也都很好。說明攜帶Xa21基因的粳稻C418對粳型不育系具有較強(qiáng)的恢復(fù)功能，所選育的新質(zhì)源均為恢復(fù)系。

從表8中看出：6個測優(yōu)組合絕大部分指標(biāo)優(yōu)于對照組合，表現(xiàn)植株高大、大穗大粒。

從表9中看出：5個恢復(fù)系相對恢復(fù)度均超過85%；超親優(yōu)勢和競爭優(yōu)勢均較大的組合有4個：09LF1-2、09LF1-7、09LF1-8、09LF1-10；恢復(fù)系分別為：08T-23、08T-29、08T-30、08T-32。說明利用新恢復(fù)系配制的雜交組合具有較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢。

3討論

國際水稻研究所從野生稻中發(fā)掘的抗白葉枯病基因Xa21抗病力強(qiáng)，抗譜廣。前人的研究結(jié)果表明，Xa21對菲律賓全部的7個白葉枯病小種具有高的抗性；Xa21對中國的主要白葉枯病小種也具有廣泛的抗性[6]。

本研究利用分子標(biāo)記輔助選擇育成的C418背景的新種質(zhì)長勢長相既像又優(yōu)于C418；既攜有Xa21基因又表現(xiàn)出對白葉枯病較強(qiáng)的抗性；同時對粳型不育系具有較好的恢復(fù)力。因此可以證明，分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合人工接種鑒定、田間農(nóng)藝性狀考察和配合力測定，可以快速高效地選育出純合穩(wěn)定的抗病恢復(fù)系。

我們對部分測恢組合進(jìn)行了分子檢測和抗病接種鑒定，F(xiàn)1出現(xiàn)目的片斷，也表現(xiàn)出對白葉枯病較強(qiáng)的抗性，說明通過雜交稻制種過程，恢復(fù)系中的抗病基因可以轉(zhuǎn)入到雜交稻中，并且抗病性高度表達(dá)；通過測優(yōu)，選育出一批優(yōu)勢雜交組合，為雜交稻抗病育種奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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