枸杞中總黃酮的分析方法及提取工藝研究

摘要：以乙醇為溶劑，采用回流提取法提取寧夏枸杞中的總黃酮。通過正交試驗，對影響提取效果的主要因素包括提取溫度、提取時間、乙醇濃度和固液比進行優化。通過試驗研究發現最優提取條件為：提取溫度70 ℃，提取時間2.0 h，乙醇濃度70%，固液比為1∶20。此法為枸杞中黃酮類化合物的提取提供了參考。

關鍵詞：寧夏枸杞；總黃酮；正交設計；回流提取

中圖分類號：R931.7文獻標識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.012

Analysis and Extractions of Bio-Flavonoid from Lycium Barbarum

LI Ming-fang1， LI Shu-fang2， WANG Xiao-qiang1， RUAN Hong-qiang1

（1. College of Science， Jiangxi Aricultural University， Nanchang， Jiangxi 330045， China; 2. Chemistry Group， Jiangxi Dongxiang No.1 Middle School， Dong xiang， Jiangxi 330018， China）

Abstract：In this paper， ethanol as solvent，refluxing extraction method used to extract total flavonoids of Ningxia Lycium barbarum. Optimize the impact of extraction of the major factors by orthogonal experiments， included extraction temperature， extraction time， ethanol concentration and the ratio of solid to liquid. The experiment found that the optimal extraction conditions were as follows: extraction temperature 70 ℃， extraction time 2.0 h， the concentration of 70% ethanol， the solid-liquid ratio of 1∶20. This method for extraction of flavonoid compounds to provide a reference.

Key words: Ningxia lycium barbarum; total flavonoids; orthogonal design; reflux extraction

植物寧夏枸杞(Lycium barbarum L. )的成熟干燥果實，具有滋補肝腎、益精明目之功效，現代臨床上廣泛用于調節免疫功能、降血脂、降血糖、保肝、抗腫瘤及抗衰老等[1]。枸杞之所以具有上述功能，一般認為與其所含黃酮類化合物、枸杞多糖、類胡蘿卜素和甜菜堿等活性成分有關，特別是與枸杞中黃酮類化合物密切相關[2]。隨著黃酮類化合物研究開發的熱潮，寧夏枸杞中黃酮類化合物的抗氧化活性開始得到關注[3-5]。

黃酮類化合物( Flavonoids) 是植物經光合作用產生的一大類化合物， 其結構母核是以C6- C3- C6 為骨架的2-苯基色原酮。它的存在形式有兩種， 一種是游離的苷元， 另一種是與糖等結合的苷。黃酮類化合物作為一種功效成分， 具有多種有益的生理功能和藥理作用， 越來越引起人們的重視。黃酮類化合物的生理活性作用較為廣泛， 具有生物抗氧化性、清除自由基作用、抗衰老、治療心腦血管疾病、降血脂降血壓作用、降低血糖作用、抗癌作用、鎮痛作用、免疫作用、抗炎作用、抗菌作用、對消化性潰瘍的保護作用等藥用保健功能。由于黃酮優越的生理功能特性，使其可廣泛應用于功能性食品中， 涉及功能食品的許多方面， 如防衰、防癌、提高免疫力、降脂、降壓食品等。此外，黃酮類化合物還可作為天然保健性食品添加劑，如天然甜味劑、天然色素、天然抗氧化劑等廣泛地應用在各類食品中[3-6]。

目前，黃酮類化合物提取方法采用較多的有：(1)有機溶劑提取法；(2)微波提取法；(3)超臨界萃取法；(4)超聲波輔助提取法。可用的檢測方法有：(1)分光光度法； (2)紙色譜法；(3)薄層色譜法（TLC）；(4)極譜法； (5)氣相色譜法；(6)高效液相色譜法( HPLC)；(7)毛細管電泳法[7-9]。根據以上各種提取方法及分析方法的特點，結合實際情況，我們選擇了以乙醇為有機溶劑的回流提取法進行提取，以分光光度法測定總黃酮的含量。本試驗通過對寧夏枸杞中總黃酮的提取方法研究，為寧夏枸杞品質的正確評價、進一步綜合開發利用寧夏枸杞資源奠定理論基礎，提供科學的依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為寧夏枸杞。

儀器：723 PCS光柵分光光度計（上海欣茂儀器有限公司，723型），電子天平（奧豪斯（上海）公司，NO.AR2140），電熱恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市京華儀器有限公司，DF-Ⅱ），電熱鼓風干燥箱（上海三發科學儀器有限公司，DHG-9101-2型），高速萬能粉碎機（FW-100型）。

試劑：蘆丁(rutin)標準品（比利時進口，北京化學試劑有限公司），亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁（Al(NO3)3 ），氫氧化鈉（NaOH），乙醇。

1.2 方 法

1.2.1 標準溶液的配制標準溶液的配制：準確稱取蘆丁標準品0.005 0 g，以70%乙醇溶解，待溶解后用70%的乙醇定容到100 mL容量瓶中，即得濃度為 0.5 mg·mL-1的標準溶液。

1.2.2標準曲線的繪制 分別吸取0.50，1.00，

1.50，2.00，2.50，3.00，3.50，4.00，4.50，5.00 mL的標準溶液至25 mL容量瓶中，分別加入0.80 mL 5%的NaNO2溶液，混勻后放置6 min；然后再加入0.80 mL 10 %的 Al(NO3)3 溶液，混勻后放置6 min；最后加入10.00 mL 4%的NaOH溶液，以70%的乙醇定容，搖勻，放置10 min；以試劑作空白參比， 在波長 510 nm 處進行比色測定。測定結果以濃度（C）mg·mL-1為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，用最小二乘法求出回歸方程，得到線性回歸方程為： C= 0.097 28 A + 0.001 62 ； 相關系數為 R2=0.999 6 。

1.2.3樣品的制備枸杞于65 ℃烘干粉碎后，過250 μm篩，以四分法制得粉狀樣品，置于干燥器內備用。

準確稱取樣品5.000 0 g于磨口圓底燒瓶中（其中加入不同濃度的乙醇溶液），置于恒溫水浴鍋中，提取黃酮，經濃縮過濾后定容至100 mL。放入冰箱4 ℃保存備用。

1.2.4樣品中總黃酮含量的測定 測量樣品時，從中準確吸取5.00 mL溶液于25 mL容量瓶中；加入0.80 mL 5%的NaNO2，混勻后放置6 min；然后再加入0.80 mL 10%的Al(NO3)3溶液，混勻后放置6 min；最后再加入10.00 mL 4%的NaOH溶液，以70%的乙醇定容，搖勻，放置10 min；以試劑空白作為參比，在510 nm處對樣品進行測定。根據線性回歸方程得到總黃酮的濃度。枸杞中總黃酮含量的計算：

總黃酮含量=×100%

2結果與分析

2. 1單因素試驗方法

2. 1. 1 乙醇濃度對提取效果的影響分別取枸杞粉樣品5 g，料液比 1∶10，提取溫度 70 ℃，提取時間 1.5 h，共5組，分別用濃度為30%、45%、60%、75%、90%的乙醇，將枸杞粉和乙醇溶液置于冷凝回流的裝置中進行加熱浸提， 過濾并合并浸提液，按1.2.4法測定黃酮提取率。結果見圖1。

圖1表明，乙醇作為浸提溶劑的較適濃度范圍為60%～90%，當乙醇嘗試超過70%時，提取率沒有顯著提高。因此選擇乙醇濃度 60%、70%，80% 作為正交試驗的較優水平。

2.1.2 提取時間對提取效果的影響分別取枸杞粉樣品5 g， 乙醇濃度 70%，料液比 1∶10，提取溫度 70 ℃，共5組，提取時間分別為 1.0，1.5，2.0，

2.5，3.0 h 。將枸杞粉和乙醇溶液置于冷凝回流的裝置中進行加熱浸提， 過濾并合并浸提液， 按1.2.4法測定黃酮提取率。結果見圖2。

圖2表明，提取時間在 1.5～2.5 h 較為合適，當提取時間超過 2 h 時，提取率沒有顯著提高。因此，選擇提取時間 1.5，2.0，2.5 h作為正交試驗較優水平。

2.1.3 提取溫度對提取效果的影響分別取枸杞粉樣品5 g， 乙醇濃度 70%，料液比 1∶10，提取時間1.5 h，共5組，提取溫度分別為40 ，55，70，85，

100 ℃。將枸杞粉和乙醇溶液置于冷凝回流的裝置中進行加熱浸提， 過濾并合并浸提液，按1.2.4法測定黃酮提取率。結果見圖3。

圖3表明，提取溫度在60～80 ℃較為合適，當溫度達到100 ℃時，黃酮類物質被破壞。因此，選擇提取溫度 60，70，80 ℃ 作為正交試驗較優水平。

2.1.4固液比對提取效果的影響分別取枸杞粉樣品5 g，乙醇濃度 70%，提取溫度 70 ℃，提取時間1.5 h，共5組，固液比分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 。將枸杞粉和乙醇溶液置于冷凝回流的裝置中進行加熱浸提， 過濾并合并浸提液，按1.2.4法測定黃酮提取率。結果見圖4。

圖4表明，固液比在1∶15～1∶20內較為合適，當超過1∶20時，黃酮提取的效果提升不明顯。因此，選擇提取的固液比 1∶10，1∶15，1∶20 作為正交試驗較優水平。

2. 2 正交試驗設計

為了進一步找出溫浸法提取的最佳試驗條件，將乙醇濃度（A），提取時間（B），固液比（質量比）（C），水浴溫度（D）4個因素進行正交試驗設計。試驗因素水平見表1。

采用L9（34）正交表進行試驗，以總黃酮得率為考察指標。

2. 3 試驗的最佳條件

通過對試驗誤差的計算，并以試驗誤差去檢驗各因素的顯著性，最后經方差分析可知。影響總黃酮提取的因素為D＞B＞C＞A，即水浴溫度＞提取時間＞固液比＞乙醇濃度。由于采用了單因素試驗優化實驗條件，使得A、B、C、D因素對其均無顯著性影響（P＞0.05），故確定最佳提取工藝為D2B2C3A2，因為早連續提取法中70 %的乙醇提取時總黃酮的含量較高，所以本試驗確定提取時間為2.0 h，水浴溫度為70 ℃，固液比為1∶20，乙醇濃度為70%為優選提取工藝。試驗結果見表2，分析結果見表3。

2. 4 樣品分析

當使用優選提取工藝D2B2C3A2，即提取時間為2.0 h，水浴溫度為70 ℃，固液比為1∶20，乙醇濃度為70%，提取枸杞中的總黃酮，平行做3組。此條件下黃酮提取率平均可達0.736%。

2. 5 加標回收試驗

為了考察方法的可行性，本試驗取一份提取液樣品，進行了加標回收試驗，結果見表4。結果表明，回收率在93.16%～105.2% 之間，準確度較好，表明方法可行。

回收率=×100%

3結 論

本試驗采用以乙醇為溶劑回流提法提取枸杞中黃酮類化合物，研究了不同乙醇濃度、浸提時間、料液比、提取溫度對黃酮類化合物提取效果的影響。采用分光光度計法， 以蘆丁為標準樣， 測定黃酮提取率。試驗結果表明: （1）采用以乙醇為溶劑的回流提取時，影響總黃酮提取的主次因素依次為： 水浴溫度＞提取時間＞固液比＞乙醇濃度。（2）寧夏枸杞中黃酮類化合物的最佳提取工藝為: 提取溫度70 ℃，提取時間2.0 h，乙醇濃度70%，固液比為1∶20，此條件下黃酮提取率可達0.736%。

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