晉大52\\57及其后代群體POD\\SOD同工酶遺傳多樣性及聚類分析

摘要：對晉大52（母本）、晉大57（父本）及其6個有代表性的后代SN-1、SN-2、SN-3、SN-4、SN-5、SN-6花莢期超氧化物歧化酶(S0D)和過氧化物酶(POD)兩種同工酶，進行電泳圖譜檢測和分析，把SOD酶譜分為3個區，A區有3條酶帶（Rf=0.27，0.41，0.44），B區有3條酶帶（Rf=0.55，0.59，0.62），C區有3條酶帶（Rf=0.68，0.74，0.79）；POD同工酶電泳顯示有13條酶帶，其中3、5、11、13號酶帶出現頻率為100%，1、2、10號酶帶頻率均在85%以上，8種材料共出現78條酶帶，平均每種材料9.8條。后代品種與父本的平均遺傳距離為0.168 6，與母本的平均遺傳距離為0.387 6。

關鍵詞：大豆；同工酶；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號：S565.1文獻標識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.002

Genetic Diversity and Cluster Analysis of Soybean POD， SOD Isozymes

HU Pei-pei，LI Gui-quan

(College of Agricultural，Shanxi Agricultural University，Taigu， Shanxi 030801，China)

Abstract：A population constructed from a cross between Jinda52 and Jinda57 were used as materials in this paper. By the analysis of POD electrophoresis spectrum， we concluded that there were 13 enzyme spectrum， and 78 enzyme spectrum in all 8 materials. SOD enzyme spectrum included 3 regions， the numbers of electrophoresis profile and the moving distance were basically the same in cross population， except for the color deepness in the profile， and so was SDS-PAGE electrophoresis， this is completely different from POD enzyme. The genetic distance between offspring and male is 0.168 6， between offspring and female is 0.387 6. These results were very significance to specific classifying and relationship researching.

Key words: soybean；isozymes；genetic diversity；cluster analysis

同工酶是由同一基因位點不同等位基因編碼的具有同一底物的蛋白質分子， 在植物器官中普遍存在[1]，具有組織、發育和物種的特異性。同時它也是較好的遺傳信息標志，其電泳圖譜譜帶的多少及譜帶的多態性變化，反映了生物在蛋白質水平上的多樣性，是生物發生遺傳分化的證據，可作為遺傳多樣性的生化標記。從20世紀60年代開始，同工酶被廣泛地應用于大豆分類、遺傳[2-3]、變異[4]和親緣關系[5-7]研究中，獲得了一定的進展。楊琪等[8]認為大豆同工酶與雜種優勢及產量性狀變異相關，用酯酶與過氧化物酶同工酶分析后得出結論：具有互補帶的組合雜種優勢高；類型相同的雜交組合F1代無互補酶帶；含秣食豆種質組合F1代互補帶比率高；F2單株同工酶酶譜類型豐富的組合，產量性狀變異潛力大。缺失型酶譜組合的F1代，主要產量性狀均值最低。虞京葳等[9]利用PAGE法研究了大豆的分類，用酯酶同工酶分析大豆幼苗，結果酶帶明確，具有較為明顯的種的專一性，對栽培大豆(G.max)與野生大豆(G.soja)的酯酶分析同形態分類學研究相互驗證結果較為一致。裴顏龍等[10]、鐘珍萍等[11]分別報道了對大豆亞屬間、種間的酶譜譜型分析，證實種群間有明顯的遺傳分化，指出染色體組型同酶帶譜型有關系，相近的材料譜型及酶活性相似，證明中國為野生大豆遺傳變異中心。

本研究對晉大52（母本）、晉大57（父本）及其6個有代表性的后代SN-1、SN-2、SN-3、SN-4、SN-5、SN-6花莢期過氧化物酶(POD) 、超氧化物歧化酶(SOD)兩種同工酶[12]進行了電泳圖譜檢測和分析，通過對酶譜進行相似性和聚類分析，研究了晉大52 、晉大57雜交親本及其后代群體之間酶系統的多樣性，旨在對今后進行大豆品種的分類及親緣關系的研究提供借鑒。

1材料和方法

1.1試驗材料

晉大52（母本）、晉大57（父本）及其6個有代表性的后代SN-1、SN-2、SN-3、SN-4、SN-5、SN-6。

1.2過氧化物酶（POD）

花莢期取幼葉各0.5 g，樣品提取液（Tris 1.21%，用HCl調pH=8.0）1.5 mL；采用不連續垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法[13-15]。染色采用醋酸聯苯胺法。測量酶帶遷移率（Rf=酶帶遷移距離/前沿指示劑距離）。

1.3超氧化物歧化酶（SOD）

花莢期取幼葉各0.5 g，提取液（Tris-Gly pH8.7）1.5 mL；采用不連續垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠濃度為10% pH8.9 ，濃縮膠濃度為2.5% pH6.7。染色：（1）在2.45 mmol·L-1氮藍四唑（NBT中），遮光，浸搖20 min；（2）在3.6 mmol·L-1 pH7.8磷酸緩沖液（含28 mmol·L-1 四甲基己二胺，28 μmol·L-1核黃素，10 μmol·L-1 KCN）中浸搖15 min；（3）浸在含0.1 mmol·L-1EDTA的50 mmol·L-1 pH7.8磷酸緩沖液中，在光照培養箱中照射20~25 min，清水漂洗，照相 [16-18]。

1.4 大豆種子SDS-PAGE

每份試樣取單粒種子脫殼，置于無菌的雙層濾紙間，用小鐵錘碾碎成粉末，將粉碎樣品置于1.5 mL的離心管中，用三氯甲烷∶甲醇∶丙酮（2∶1∶1）進行脫脂；提取樣品時加入Samplebuffer（pH6.8，1 mol·L-1Tris-HCl 5.0 mL+20%SDS 2 mL+甘油8.0 mL+α巰基乙醇3.6 mL+溴酚藍20.0 mg，稀釋4倍）；電泳采用聚丙烯酰胺垂直板非連續系統；用0.25%考馬斯亮藍R-250染色。

2結果與分析

2.1晉大52、晉大57及其后代種子SDS-PAGE分析

采用10%的SDS-PAGE法分離大豆HMW-GS，由圖1可以看出，品系間譜帶數目的變異范圍在20條帶左右，品系間譜帶基本一致，差異較小，只是在帶的強弱上有區別，只有CK1 （父本晉大57）出現了特異帶Rf=0.27。

2.2超氧化物歧化酶同工酶分析

本試驗分離的SOD同工酶掃描圖見圖2，從圖2中可以看出，被測的8個材料中，花莢期SOD同工酶共出現9條酶帶，根據遷移率（Rf）可將酶譜分為3個區：A區有3條酶帶（Rf=0.27，0.41，0.44），B區有3條酶帶（Rf=0.55，0.59，0.62），C區有3條酶帶（Rf=0.68，0.74，0.79），這與前人的研究結果是一致的[19-22]。所不同的是C區的3條酶帶顏色深、酶帶寬、酶活性強；B區的酶帶顏色較深，活性較強，酶帶比C區的相對較窄；A區第二條帶（Rf=0.41）顏色深，酶活性強，第一、三條帶顏色淡、活性較弱。晉大52、晉大57及其后代群體超氧化物歧化酶同工酶譜帶基本相同（沒有條帶的缺失及遷移率的變異），有很大的同源性，品系間的差異僅體現在某些酶帶的強弱上。

2.3過氧化物酶同工酶分析

2.3.1過氧化物同工酶酶譜特征 分析POD同工酶電泳掃描圖，計算各酶帶的Rf值，繪制POD同工酶模式圖（圖3），共出現13條酶帶。本研究根據遷移率將酶譜分成3個區：Ⅰ區（慢區）Rf值在（0.25~0.35）之間，共5條帶；Ⅱ區（中區）Rf值在（0.50~0.54）之間，共3條帶；Ⅲ區（快區）Rf值在（0.59~0.69）之間，共5條帶。它們在不同材料中出現的頻率也各不相同（見表1），其中3、5、11、13號酶帶出現頻率為100%，所有試材中均有這兩條酶帶，這為晉大52、晉大57及其雜交后代過氧化物酶同工酶的特征譜帶。第1、2、10號酶帶出現頻率均在85%以上，可認為是該群體的基本穩定譜帶。從基本酶譜可知，Ⅰ區、Ⅲ區的酶帶數多，顯色深，酶帶寬；而Ⅱ區酶帶數少，顯色淺，酶帶窄，這說明慢、快區的酶活性強，較穩定，在研究中可能有較高的利用價值。

從圖3、表1中可以看出:各供試材料在花莢期葉片POD同工酶酶譜特征明顯不同，8種材料出現的POD同工酶酶帶總數為78條，每種材料平均為9.8條，品系間酶帶數的差異也較大，最少的有8條，最多的達到12條，而且在酶帶的組合形式上也表現各異。說明花莢期POD同工酶酶帶比較豐富，并且不同材料間POD同工酶酶譜酶帶數、酶帶位點（Rf值）、和酶帶強弱（顏色深淺）均存在著不同程度的差異，同時也說明不同材料的POD同工酶蛋白質表達水平不同，體現了基因水平上的差異。

2.3.2POD酶譜的相似性根據POD同工酶電泳模式圖，將有帶量化為1，無帶量化為0（表1），計算成對品系的相似系數Sij和遺傳距離Dij，計算公式為：

Sij=2Nij/（Ni+Nj）Dij=1 - Sij

其中Nij為兩個品系共有的條帶數，Ni和Nj分別為第i個和第j個品系各自的條帶數[23]。 Sij越接近1.0，所比較的兩個品系的相似程度越高。由此可以得到相似系數矩陣（表2）。由表計算，SN-1、SN-2、SN-3、SN-4、SN-5、SN-6與父本的平均遺傳距離為0.168 6，與母本的平均遺傳距離為0.387 6。

2.3.3POD聚類分析在POD酶譜相似系數的基礎上采用SAS軟件系統聚類平均法（UPGMA）[24-25]進行聚類分析，并得到樹形圖（圖4）。

由樹形圖(圖4)可以看出，在類平均距離為3.82的水平上，所有品系被聚為兩大類：第一大類包括晉大57、SN-4、 SN-1、SN-2、SN-5、SN-3，說明SN-4、 SN-1、SN-2、SN-5、SN-3與父本晉大57親緣關系較近。該類在類平均距離為2.50處分又可以為兩個亞類，第一亞類（晉大57、SN-4、SN-1）與第二亞類（SN-2、SN-5、SN-3）。父本晉大57被聚在第一亞類中，可見SN-4、SN-1與父本的親緣關系更為接近；第二大類包括晉大52和SN-6，說明SN-6與母本的親緣關系最為接近。聚類結果在一定程度上反映了子代品系間及子代與父母本親緣關系的遠近。

3討論

3.1同工酶酶譜變異及其意義

同工酶與基因的表達有著直接的聯系，它是生物遺傳多態性在分子水平上的表現，同時在一定的發育階段和特定的組織器官中同工酶譜具有相對穩定性，以及有一定的遺傳傳遞規律，因此被廣泛用于植物遺傳育種，物種起源與分類，雜種優勢預測和抗病性篩選，植物生理生化等研究領域[26-31]。

本試驗根據遷移率（Rf）將SOD酶譜分為3個區：A區有3條酶帶（Rf=0.27，0.41，0.44），B區有3條酶帶（Rf=0.55，0.59，0.62），C區有3條酶帶（Rf=0.68，0.74，0.79），這與前人的研究結果是一致的。而且親本及其后代群體SOD同工酶譜帶基本相同，有很大的同源性，差異僅體現在某些酶帶的強弱上。POD同工酶電泳顯示有13條酶帶，可分為3個區，Ⅰ區（慢區）、Ⅲ區（快區）酶帶數多，顯色深，酶帶寬；而Ⅱ區（中區）酶帶數少，顯色淺，酶帶窄；其中3、5、11、13號酶帶出現頻率為100%，1、2、10號酶帶出現頻率均在85%以上，8種材料共出現78條酶帶，平均每種材料9.8條。說明花莢期POD同工酶酶帶比較豐富，組合形式上也表現各異。不同品系的POD同工酶酶譜之間既具有某些相同點，又各自具有自身的特征，反映出不同品系之間的相互聯系與區別。

試驗證明，POD同工酶指標在大豆品系中更具有多態性，體現了蛋白質表達水平和基因水平上的差異。因此，對雜交后代不同品系之間POD同工酶的測定，再輔以其他區域的差異及酶活力的差異，可為大豆品種親緣關系的鑒定提供依據，并為篩選優良的雜種后代提供一定的科學依據。

3.2本試驗的局限性

本試驗利用同工酶分析技術，從蛋白質水平、遺傳背景方面來尋找大豆不同品系間的親緣關系，可能會存在一些不足之處。首先，在進行酶提取、活性測定或電泳染色時酶活性與酶本身結構會發生變化，因此操作結果的重復性不強。其次，電泳只能檢測編碼酶蛋白的基因位點，對非結構基因則無能為力，所檢測的位點數不可能很多(一般少于30個)，一批等位酶位點變異并不一定代表整個基因組的變異，且有些隱避的變異可能無法用電泳檢測到，在要求結果準確的檢測中，同工酶檢測技術只能用作輔助手段。再者，與大豆產量相關的性狀多屬數量性狀，而同工酶標記位點較少，因此難于準確標定。最后，在聚類方法上，本試驗采用二態性狀對POD酶帶進行標記，是以酶帶的有無作為分類的依據，沒有酶量和酶活性的信息參與，這除了試驗本身的限制外，考慮到酶帶的有無比深淺（表示酶活性和酶量）更具有較大的遺傳差異，前者是質的差別，后者是量的差別。當然，如果把酶量的差異考慮進去，以及結合多酶系統、形態特征和分子標記的研究，將會使大豆品種的親緣關系和多態性研究更趨于合理和真實，對大豆的雜交育種也具有較好的指導意義。

4結論

通過對晉大52（母本）、晉大57（父本）及其6個有代表性的后代SN-1、SN-2、SN-3、SN-4、SN-5、SN-6進行花莢期超氧化物歧化酶(SOD) 、過氧化物酶(POD)兩種同工酶的電泳圖譜檢測和分析，把SOD酶譜分為3個區：A區有3條酶帶（Rf=0.27、0.41、0.44），B區有3條酶帶（Rf=0.55、0.59、0.62），C區有3條酶帶（Rf=0.68、0.74、0.79），譜帶基本相同，有很大的同源性；POD同工酶電泳顯示有13條酶帶，其中3、5、11、13號酶帶出現頻率為100%，1、2、10號酶帶頻率均在85%以上，8種材料共出現78條酶帶，平均每種材料9.8條，說明POD酶帶豐富，變異程度高。利用聚類分析，6個后代與父本的平均遺傳距離為0.168 6，與母本的平均遺傳距離為0.387 6。

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