蚯蚓MT基因植物表達載體的構建及煙草轉化

摘要：為了提高植物對重金屬的耐受力和富集能力，從而減少重金屬對土壤的污染，本研究將克隆的赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）MT 基因，裝入植物表達載體pPZP111，構建了植物表達載體pPZP-efMT。然后用三親法將其導入根瘤農桿菌EHA105中，通過葉盤法轉化煙草。經PCR檢測，efMT基因已整合到煙草基因組中，為進一步驗證轉基因煙草的抗重金屬能力奠定了基礎。

關鍵詞：MT基因；表達載體構建；根瘤農桿菌；煙草轉化

中圖分類號：Q782文獻標識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.013

Construction of Plant Express Vector of Metallothionein Gene and Transform Tobacco

LI Ya-li， LI Ji-gang， LIU Lan-fang

(College of Life Sciences， Hebei University， Baoding 071002， China)

Abstract：In order to improve the plants， capabilities of tolerance and heavy metals of enrichment， eventually reduce the pollution of soil， the Eisenia foetida MT gene by PCR and successfully constructed the express vector pPZP-efMT were cloned. The recombined vector was transformed into the EHA105 by triprental cross， and then was transformed tobacco by leaf-disc method. Transgenic tobaccos were identified by PCR. All of this process would make the foundation of plant anti-metals.

Key words: metallothionein gene; expression vector construction; Agrobacterium tumefaciens; transform tobacco

隨著工農業生產的發展和人類活動的增加，重金屬(主要是指Hg、Cd、Pb、Cr及類金屬As等金屬）或者是具有一定毒性的一般重金屬(如Zn、Cu、Co、Ni等)對環境的污染日益嚴重，且造成了巨大的損失，事實證明，重金屬污染的治理已刻不容緩。由于環境中的重金屬具有長期性、隱蔽性和嚴重性，且經常是多種重金屬形成復合污染，使得重金屬污染的治理較為困難。傳統清除重金屬污染的方法由于有成本過高、操作不便、易造成二次污染、還會導致土壤結構的破壞和肥力的下降、只能小面積進行等缺點而無法大規模推廣。生物修復以其特有的優勢，越來越受到人們的廣泛關注。它是利用天然或人工改造的生物整體或組分來處理環境污染物的方法，具有投資少、效率高、可以原位處理低濃度環境有害污染物的特性，在環境治理中顯示了極大的潛力[1]。植物修復是生物修復中的一種，是指將某種特定的植物種植在重金屬污染的土壤上，而該種植物對土壤中的污染元素具有特殊的吸收和富集能力，將植物收獲并進行妥善處理（如灰化回收）后可將該種重金屬移出土體，達到污染治理與生態修復的目的[2]。

金屬硫蛋白，化學名為金屬巰基組氨酸三甲基內鹽（Metallothionein簡寫為MT）是一種低分子量，富含Cys，并能結合重金屬的蛋白質[3]。這種存在于大多數生物體內的蛋白，其結構在進化中相當保守，功能也基本一致[4]。近年來的研究結果表明，它與抗重金屬中毒作用密切相關[5]，而且這一功能已被證實，如轉MT基因鼠中MT過量表達可降低由鎘引起的死亡率，而敲除MT基因的小鼠會得出相反的結果[6]。

蚯蚓能夠選擇性吸收并富集土壤或垃圾中的鎘[7]，形成類似MT特征的低分子量金屬結合蛋白[8]。目前許多研究成果表明，MT基因轉入植物并有效提高植物對重金屬的抗性。但是這些轉入植物的MT基因多與哺乳動物有關，以低等環節動物為研究對象的較少，而且目前尚未見蚯蚓MT基因植物表達載體構建方面的報道，鑒于MT具有很強的重金屬結合功能，本試驗將蚯蚓MT基因裝入植物表達載體pPZP111中，并將其轉化煙草，初步獲得轉基因煙草，為進一步驗證轉基因植物的抗重金屬特性奠定了基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1植物材料野生煙草心葉煙。

1.1.2菌株和質粒根瘤農桿菌菌株EHA105；大腸桿菌菌株HB101和JM109；植物表達載體pPZP111；pBI-X為本實驗室構建的由約為750bp外源基因X代替GUS基因的植物表達載體；質粒pMD19-T-efMT為本試驗保存。

1.2方法

1.2.1 引物設計及PCR用Primer Premier 5.0軟件設計PCR擴增efMT基因的引物并由博邁德生物公司合成。其序列如下：正向引物atMTxf：5′-AGCTCTAGATGGATACTCAGTGCTGTGGA-3′（下劃線部分為Xba I酶切位點）反向引物atMTsr：5′-TATGAGCTCACTAGTCACCACAGCATC-3′（下劃線部分為Sac I酶切位點） 預計擴增的片段約為250bp。

以TA克隆制備的pMD19-T-efMT為模板，根據上面設計的引物配制PCR反應液：模板1.5 μL，正向引物（10 μmol·L-1）0.8 μL，反向引物（10 μmol·L-1）0.8 μL， Ex Taq（5 U·μL-1）0.2 μL ，10×Ex Taq Buffer 4 μL，dNTP Mixture（各2.5 mol·L-1）3.2 μL，超純水補至40 μL。PCR條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性45 s，48 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，5個循環；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，25個循環；72 ℃再延伸10 min。

1.2.2植物表達載體pPZP-efMT的構建 （1）雙酶切純化的efMT基因及回收。按照樹脂型TMPCR產物純化試劑盒說明書對PCR產物進行純化，然后將其經Xba I和 Sac I雙酶切，回收酶切產物。

（2）載體pPZP-X的構建與鑒定。用Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切pBI-X和pPZP111，分別回收X片斷和載體大片段；用T4DNA連接酶把兩片段16 ℃過夜連接，連接產物通過熱激法轉化E.coli JM109，得到重組質粒pPZP-X，酶切鑒定。

（3）表達載體pPZP-efMT的構建。重組質粒pPZP-X經Xba I和 Sac I雙酶切，回收載體大片段。將其與純化的efMT基因片段進行連接，構建表達載體pPZP-efMT，熱激法轉化E.coli JM109。得到的重組質粒pPZP-efMT經PCR及酶切鑒定正確后，委托三博遠志生物技術有限公司測序，用Vector NTI軟件進行序列分析。

植物表達載體pPZP-efMT的構建流程圖如圖 1所示。

1.2.3煙草的遺傳轉化與抗性植株的PCR檢測將重組質粒pPZP-efMT通過三親法[9]導入農桿菌EHA105，再利用葉盤法轉化煙草，最終將經過25 mg·L-1濃度氯霉素篩選的抗性植株移入溫室培養。

采用改良CTAB法[10]提取具有抗性的轉基因植株的基因組DNA，PCR鑒定。引物和PCR條件見步驟1.2.1，非轉基因煙草基因組DNA為陰性對照，pPZP-efMT重組質粒為陽性對照。

2結果與分析

2.1蚯蚓MT(efMT)基因片段PCR

pMD19-T-efMT為模板，按照程序1.2.1進行PCR擴增，得到了約為250bp大小的條帶（圖2），符合預期大小。

2.2載體pPZP-X、pPZP-efMT的鑒定

X片斷與pPZP111載體大片段連接后轉化，得到重組質粒pPZP-X。其經Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切得到約為750bp大小的片段（圖3），說明表達載體pPZP-X構建正確。

efMT基因片斷與pPZP-X載體大片段連接轉化后得到重組質粒pPZP-efMT。以pPZP-efMT為模板，PCR擴增結果與預計250bp大小一致，而陰性對照（質粒pPZP111）未擴增出相應的條帶（圖4），說明轉化子是重組子。pPZP-efMT經Xba I和 Sac I雙酶切，同樣獲得了與原目的基因大小相同的片段，說明構建的植物表達載體已經成功將efMT基因整合進去（圖5）。

2.3轉基因煙草的獲得

用含有pPZP-efMT的農桿菌侵染的煙草葉片，放入共培養基上，暗培養2~4 d。將轉化的葉片轉至含氯霉素的選擇培養基繼續培養20~30 d（如圖6 A），每隔1周將存活的葉片轉至新的培養基上，待不定芽長至2~3 cm時（如圖6 B）可移至生根培養基，1周后長出根，待植株長至5~6 cm時（如圖6 C）移到含營養土的花盆中溫室培養，即可獲得完整的轉基因煙草（如圖6 D）。

2.4轉基因煙草PCR檢測

轉基因煙草提取的葉片基因組DNA為模板進行PCR擴增，以質粒pPZP-efMT為陽性對照，以非轉基因煙草葉片基因組DNA為陰性對照。經過3次重復試驗，獲得的32株煙草植株，有7株為陽性株（圖7）。

3結論與討論

目前，MT的功能僅僅是根據MT表達行為進行的推測，而且大部分MT蛋白還未得到純化，眾多因素（如金屬離子、脅迫、發育階段等）影響它的表達，從而增加了研究其功能的復雜性和不確定性[12]。不過，對MT解除重金屬毒性這一作用的研究已有很長時間。MT的巰基基團（-SH）能強烈螯合有毒重金屬汞、鉛、鎘、銀等。Park等研究敲除MT基因的小鼠發現，MT對一些重金屬的解毒能力的順序為Cd>Zn>Cu≈As>Hg[12]，而且MT的環境保護作用也有研究得以證實。李偉等 [13-14]研究發現，轉小鼠MT基因的矮牽牛和煙草能排除土壤中的鉛，其中，轉基因煙草可以利用根部吸附大量重金屬（包括鉛），隨后將這些吸附了重金屬的植物焚化，這樣吸附的重金屬則可以在灰燼中被安全地清除出去使土壤凈化。

利用基因工程手段提高植物對重金屬的抗性是目前研究熱點之一。1987年，Lane等[15]證明，倉鼠MT基因可以在植物中表達，并且可以提高植物對鎘耐受力。隨后，人們又相繼將不同來源的MT基因轉入植物，得到了能耐鎘和銅的轉基因植物[16-19]。以上研究表明，MT基因可在植物中表達，且能夠提高植物耐受和富集重金屬的能力。因此，開發出超強耐受和富集重金屬的植物用于修復環境是很有前途的。

本試驗將克隆的蚯蚓MT基因重組于質粒pPZP-111，成功構建了高效的植物表達載體pPZP-efMT，利用農桿菌介導轉入煙草。在選擇培養過程中有一部分葉片組織由于褐化死亡，有些起初分化出芽的組織經過30 d的繼代培養也逐漸枯萎死亡，表明目的基因沒有成功轉入其內，只有通過生根培養后生長狀態良好的植物才有可能是轉基因植株。

本試驗通過PCR這種簡單迅速的手段檢測轉基因植株，陽性植株均能擴增出與目的片段一致的特異性條帶。說明MT基因已經整合到植物基因組中。有一部分在選擇培養和生根培養過程中生長正常的植株，PCR檢測未能擴增出特異性條帶，為假陽性植株。分析原因可能是抗生素濃度較低，可以適當加大抗生素濃度來提高轉化率。

成功構建植物表達載體和蚯蚓MT基因整合到煙草基因組中這一初步成果，為利用MT基因的高誘導性和通過MT基因啟動子建立MT的高效表達系統[16]的研究奠定了堅實的基礎，也進一步為研究轉MT基因植物用于土壤修復打下良好的基礎，而且MT也可作為重金屬標志物用于環境和土壤生態系統的監測[20]。但是，研究也發現有部分轉基因株系后代中存在基因丟失和重組等遺傳效應 [21]。因此，提高外源基因在轉基因植株中的穩定性和避免基因失活是值得深入研究的問題。我們研究所得的轉基因植株也必須經過長時間的鑒定和篩選才能應用到實踐中。

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