蟲草制品中核苷類有效成分分析方法研究

摘要：采用HPLC法建立測(cè)定蟲草中11種有效成分的分析方法。采用碳十八色譜柱，甲醇和磷酸鹽水溶液進(jìn)行梯度洗脫，11種有效成分分別為：胞嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥苷、2’-脫氧胸苷、腺苷、蟲草素。考察了方法的線性范圍、穩(wěn)定性以及儀器的精密度。 試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示上述指標(biāo)均在可接受的范圍內(nèi)。

關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜法；冬蟲夏草；北冬蟲夏草；金水寶膠囊；寧心寶膠囊；核苷類物質(zhì)

中圖分類號(hào)：Q525文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.010

Research on Analytic Methods of Nucleotides in Cordyceps Preparation

CHEN Wei1，HUANG Kai-hua1， FU Ting2， ZHOU Qing-lin3， GAO Xin-hua1， ZHANG Hong-xia1

(1. Plant Protection Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China;2. Analysis and Testing Center， Shenyang Agricultural University， Shenyang， Liaoning 110161， China， 3. Fuxin Forest Technology Extension Station， Fuxin， Liaoning 123000， China)

Abstract：A high performance liquid chromatographic(HPLC) method was developed for the determination of nucleotides. Meanwhile， a comparative analysis of nucleotides in Cordyceps preparation was conducted by the developed method. Results showed that a good separation of Cytosine， Uracil， Hypoxanthine， Uridine， Thymine， Adenine， Inosine， Guanidine， 2’-thymidine， Adenosine， cordycepin were achieved. This method was stable， precise and reproducible and was successfully applied to the determination of nucleosides in cordyceps preparation.

Key words: HPLC; Cordyceps sinensis; Cordyceps militaris; Jinshuibao capsule; Ningxinbao capsule; nucleotides

冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)隸屬麥角菌科蟲草屬，是一種極具保健功能的藥用真菌[1-2]，具有調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)活性、抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)腎功能、恢復(fù)肝功能、調(diào)節(jié)心血管功能等功效，但冬蟲夏草對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求比較苛刻，價(jià)格昂貴，因此具有相似生理功效的其他蟲草類制品便獲得廣泛的應(yīng)用[3-4]。

以往研究實(shí)踐表明，不同來(lái)源的蟲草制品在有效成分種類及其含量上存在些許差異，目前對(duì)其的研究?jī)H限于蟲草酸、蟲草多糖及少量的核苷類物質(zhì)如蟲草素、腺苷等，偶見(jiàn)對(duì)多種核苷類有效成分進(jìn)行分析研究的報(bào)道[5-7]，但各組分之間分離度比較差。本試驗(yàn)擬采用反相高效液相色譜法[8-13]對(duì)11種核苷類物質(zhì)進(jìn)行分析測(cè)試，以達(dá)到質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)的目的。試驗(yàn)結(jié)果表明，11種核苷類物質(zhì)在同一色譜條件下均得到較好的分離，并可以進(jìn)行含量測(cè)定，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可以作為判定蟲草制品質(zhì)量的一種方法。

1材料和方法

1.1儀器與試劑

SUMMIT液相色譜儀（美國(guó)戴安公司，包括P680型四通道低壓泵，ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC-100柱溫箱，UVD170U紫外檢測(cè)器，變色龍(Chromeleon)色譜工作站）； 德國(guó)Sartorius BS 210S電子天平；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器；Effendorf Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī)，SKY-2102控溫?fù)u床。

標(biāo)準(zhǔn)品：胞嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2’-脫氧胸苷、腺苷、蟲草素，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，色譜純甲醇，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；超純水為自制。所有溶劑均經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾并超聲后使用。北冬蟲夏草子實(shí)體由本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)，冬蟲夏草購(gòu)自西藏那曲，金水寶膠囊（江西濟(jì)民可信金水寶制藥有限公司），寧心寶膠囊（長(zhǎng)春普華制藥股份有限公司）。

1.2樣品前處理

精確稱取0.5 g試樣，80 ℃水浴2 h，定容至50 mL，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。每次分析均需同時(shí)做試劑空白。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取11種有效成分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 mg，經(jīng)超純水溶解后，用50 mL容量瓶定容，配置成200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分取該溶液用超純水逐級(jí)稀釋成100，50，20，10 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用0.22 μm濾膜過(guò)濾后分別進(jìn)樣。

1.4色譜條件

色譜柱：CNW silC18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇與磷酸二氫鉀溶液梯度洗脫；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2結(jié)果與分析

2.1流動(dòng)相的選擇

主要考察了幾組的流動(dòng)相：甲醇∶水（體積比為15∶85）；乙腈∶水（體積比為4∶96）；1‰三氟乙酸∶甲醇體積比為（15∶85）；0.01 moL·L-1磷酸二氫鉀∶甲醇（體積比為15∶85）；0.01 moL·L-1磷酸二氫鉀:甲醇（梯度洗脫）。結(jié)果顯示，前兩組流動(dòng)相中色譜峰拖尾現(xiàn)象比較嚴(yán)重，分離度比較差；第3組流動(dòng)相色譜峰分離度較好，但重復(fù)性比較差；第4組色譜峰重復(fù)性較好，但個(gè)別峰分離度差；因此選擇第5組梯度洗脫方式，各色譜峰的分離度及重復(fù)性都比較好。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍試驗(yàn)

在上述色譜條件下， 用標(biāo)準(zhǔn)液系列中各組分的峰面積與濃度數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)證明，11種標(biāo)準(zhǔn)樣品在10～200 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。各組分相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.999以上，完全滿足定量分析的需要。

2.3精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)

在上述色譜條件下，對(duì)11種標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定5次， 以峰面積計(jì)算 RSD值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，各標(biāo)準(zhǔn)樣品的RSD值在0.98%~1.96%之間，表明試驗(yàn)精密度良好。

取1份標(biāo)準(zhǔn)液分別在0，6，12，18，24 h進(jìn)樣測(cè)定，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，各標(biāo)準(zhǔn)樣品的RSD值在1.03%~3.86%之間，表明樣品在24 h內(nèi)都較穩(wěn)定，可滿足測(cè)定需求。

2.4不同北冬蟲夏草核苷類物質(zhì)含量測(cè)定

利用1.3中方法處理北冬蟲夏草樣品，0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣10 μL。通過(guò)表1計(jì)算各核苷類物質(zhì)含量，分析結(jié)果見(jiàn)圖2及表1。

由上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，不同的蟲草制品中核苷類物質(zhì)種類及含量不盡相同。北冬蟲夏草中含有其他3種蟲草制品所沒(méi)有的蟲草素，而且次黃嘌呤相對(duì)較多；冬蟲夏草中胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶含量相對(duì)較多；金水寶中肌苷及腺苷含量相對(duì)較多；寧心寶中尿苷、腺嘌呤、鳥苷及2’-脫氧胸苷含量相對(duì)較多。不同的核苷類物質(zhì)有不同的功效，應(yīng)該以不同的藥理功效來(lái)對(duì)不同蟲草制品進(jìn)行應(yīng)用。

3結(jié)論

本試驗(yàn)采用梯度洗脫的方法對(duì)4種蟲草制品中的多種核苷類物質(zhì)進(jìn)行了分析測(cè)定研究。結(jié)果顯示，該方法不但使11種標(biāo)準(zhǔn)樣品從基線處完全分開(kāi)，分離度相當(dāng)?shù)暮谩Ｇ以摲椒疾炝朔椒ǖ木€性范圍、穩(wěn)定性、重復(fù)性、重現(xiàn)性以及儀器的精密度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示上述指標(biāo)均在可接受的范圍內(nèi)。各蟲草制品中未知成分之間分離度也比較好，說(shuō)明該方法適用范圍廣，可以作為綜合評(píng)價(jià)蟲草制品的方法進(jìn)行推廣使用。

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