辣椒細胞質雄性不育系和保持系SSH-cDNA文庫的構建

摘要：以辣椒細胞質雄性不育系A1、A5為驅動方(driver)，以其相應的保持系B1、B5為測驗方(tester)，利用抑制差減雜交技術構建了1個辣椒細胞質雄性不育保持系表達基因的正向差減cDNA文庫。從差減文庫中篩選到189個陽性單克隆，經高密度點陣膜雜交篩選和測序分析。共獲得了42條表達序列標簽(ESTs)。BLAST比對分析后，得到了35條有比對結果的序列，其中包括26條已知功能基因序列和9條未知功能基因序列，已知基因功能多與基礎物質代謝、脅迫應答、信號轉導等方面有關；有7條ESTs沒有比對結果，可能代表一些新基因。

關鍵詞：辣椒：細胞質雄性不育；保持系：抑制差減雜交：差異表達

植物細胞質雄性不育(cytoplasmie male sterilitvCMS)是指植物在有性繁殖過程中花粉敗育而雌蕊功能正常的現象。高等植物CMS現象最早于1943年由瓊斯在洋蔥中發現，目前，有關玉米、小麥、水稻、蘿卜、甘藍型油菜等植物CMS相關機理和相關基因功能等方面研究較多。Kim等利用同源克隆的方式，在辣椒上找到了1個開放閱讀框orf456，并通過多種方式驗證了其與不育基因的密切相關性：羅向東等對CMS不育系和保持系進行了AFLP分析，篩選出1條差異條帶：其他的研究也以類似的同源克隆或分子標記方法在辣椒CMS不育材料中找到了一些與不育基因相關的標記或序列。但是對于辣椒保持系相關基因的研究報道并不多。保持系與不育系的細胞核遺傳背景相同，只在細胞質基因上有差異，而線粒體DNA被認為是CMS因子的載體，所以研究保持系細胞質相關可育基因將有助于更好地了解CMS不育過程和闡述CMS不育機理。

抑制差減雜交(suppression subtractive hvbridization.SSH)是用于分離理論上只在1個研究點上有差別的2個mRNA群體差異表達基因的一種技術。它克服了以往雜交方法高豐度易得，低豐度難求的技術限制，運用雜交二級動力學原理和抑制PCR的方法，較高效的富集出差異表達片段，是；與前使用較為廣泛的一種差異表達基因克隆方法。

本研究旨在以SSH技術為手段，篩選出與辣椒CMS育性保持基因相關的cDNA片段，構建差減文庫：并通過基因功能注釋與分類分析，初步了解了辣椒CMS育性保持相關基因的功能、種類和數量，為CMS不育與保持分子機理的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

2份辣椒細胞質雄性不育系與相應的保持系均由中國農業大學辣椒課題組培育而成。其中A1和B1為燈籠形甜椒材料，A5和B5為羊角形辣椒材料。2份不育系和保持系均以8907A為不育源，經連續回交7代以上轉育而成，不育性穩定；保持系與不育系只在細胞質遺傳物質上有區別，細胞核的遺傳背景完全相同。試驗材料均于2010年春季在中國農業大學上莊試驗站大棚常規種植。取材時選取花瓣已轉白但并未開放的花蕾剝取花藥，經液氮速凍后保存于80℃環境中。

試驗所用Trizol試劑購于普博欣公司；PolyA。Tract mRNA isolation system kit和oGEM-T Easy載體均購于Promega公司：PCR-SelectTM cDNA Sub。traction Kit購于Clontech公司；PCR產物純化試劑盒購于OMEGA公司；Kcoli DH5a、100 bp DNAMarker購于天根公司：DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit購于Roche公司：Ton酶、dNTPs、DNA marker DL 5 000購于Takara公司；尼龍膜購自Sigma公司：其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒花藥材料mRNA抽提將采集好的4份花藥材料用液氮研磨成粉狀，采用常規Trizol法提取總RNA。然后將不育系材料A1、A5和保持系材料B1、B5分別等量混合為A、B。以其為原料，按照PolyATraet mRNA isolation system kit的使用說明，分離純化出mRNA，溶于適當體積的DEPC處理水中。所提取的RNA均使用NanoDrop微量分光光度計測定濃度，并于1％瓊脂糖凝膠上電泳檢測提取效果，然后80℃下保存備用。

1.2.2 差減cDNA文庫的構建和陽性克隆差異篩選

以不育系材料A1、A5為驅動方(driver)，以保持系材料B1、B5為測驗方(tester)，各取2μgmRNA，按照PCR-Select cDNA Subtraction Kit操作流程進行抑制差減雜交。經過cDNA雙鏈合成、Rsa I酶切、接頭連接、兩輪雜交和兩輪PCR步驟后，富集出差異性表達基因片段。

第2輪PCR產物經純化后，與DGEM-T Easy載體連接，再通過熱激法轉化到E.coli DH5a感受態細胞中，于含有Amp/X-gal/IPTG的培養基平板上篩選陽性克隆：挑取白斑菌落振蕩過夜培養，吸取適量菌液用巢式引物1(5’-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’)和巢式引物2R(5’-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’)進行PCR。PCR結果通過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

電泳后分析篩選出的PCR產物，參照DIGHighPrime DNA Labeling and Detection Starter Kit方法進行高密度點陣膜雜交，所用探針分別為正向未差減雜交cDNA和反向未差減雜交cDNA。

1.2.3 差異基因片段測序與分析通過點陣膜雜交篩選出的陽性克隆，以T7或SP6為測序引物，在北京邁奧德恩生物科技有限公司測序。測序結果去除載體、接頭序列和重復序列后，在NCBI網站(http：//www.nebi.nih.gov)上進行BLAST比對，初步分析了一些序列的可能功能。

2 結果與分析

2.1 RNA提取檢測結果

2份材料總RNA的28S和18S核糖體RNA條帶亮而濃，下方可見5S小分子量RNA，背景雜質較少，膠孔中無亮帶，說明提取的總RNA質量較好，無降解無DNA污染：抽提的mRNA條帶呈彌散狀，且分布較為均勻，說明mRNA質量良好(圖1)。總RNA和mRNA經NanoDroD微量分光光度計測得的ODz60／OD2eo值均在1.9-2.1，表明提取效果良好，可以用于后續試驗。

2.2 抑制差減雜交cDNA文庫結果

利用巢式引物1和2R進行的抑制差減雜交第2次PCR結果如圖2所示。差減骨骼肌對照第2次PCR產物帶型與骨骼肌對照Marker帶型基本一致：正向差減PCR產物比正向未差減PCR產物條帶亮度降低、范圍減小，說明酶切、連接效率較好，差減效率較高，抑制差減雜交試驗較為成功。

M.DL5000 DNA Marker：1.骨骼肌對照Marker：2.差減骨骼肌對照第2次PCR產物：3.未差減骨骼肌對照第2次PCR產物：4.正向差減第2次PCR產物：5.正向未差減第2次PCR產物。

2.3 陽性克隆差異篩選與cDNA文庫序列分析

根據藍白斑篩選原理，從氨芐青霉素平板上隨機挑取了228個白色克隆進行PCR，在2％瓊脂糖凝膠電泳上的檢測結果如圖3所示。所得的克隆基因片段大小集中于200-1000 bp，片段平均長度在500 bD左右，插入片段符合建庫要求。從中挑選出具有1個插入片段的克隆189個，陽性單克隆率為82.9％，

M.DL 1500 DNA Marker；1～9，隨機陽性克隆PCR嚴物

為了進一步剔除假陽性，篩選到文庫中真正代表差異表達基因的克隆，將所選得的陽性單克隆點在雜交膜上，分別以正反向未差減cDNA為探針進行點陣膜雜交。選擇只在正向膜上有雜交信號或在2個膜上都有雜交信號，但是在正向膜上的信號強度強于反向膜的克隆進行測序。最終挑取并成功測序的克隆有61個，這些克隆的插入片段的測序長度多集中于200-1000bp，平均序列長度約為570bp，與前面陽性克隆的PCR跑膠結果一致。去除兩端的冗余序列和重復序列后，得到42個unique ESTs、在GenBank中進行BLAST同源比較，有35條序列與網絡數據庫中的序列具有相似區域，占所有ESTs序列的83.3％，其中包括26條已知功能基因和9條未知功能基因；沒有比對結果的序列有7條，占16.7％，可能代表一些新基因。部分ESTs序列的比對結果如表1所示。

為了進一步了解這些已知功能的ESTs序列所涉及的基因種類，按照MIPS功能分類法將其分為9類，如圖4所示。分類結果表明，辣椒細胞質雄性不育育性恢復相關基因的表達產物可能與基礎代謝、脅迫應答、轉運、轉錄、信號傳導等方面有關。其中占據最大比例的是基礎代謝類，占26.9％，分為物質代謝與能量代謝兩個方面，包含細胞質葡糖磷酸變位酶、胞漿蘋果酸脫氫酶、ATP合酶β亞基等；其次是脅迫應答類，占15.4％，包含抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶、熱激蛋白70等逆境作用酶類；此外，蛋白活性類、轉錄、轉運、信號轉導類也各占據了一定比例，說明了保持系的育性保持功能是通過細胞內多方面的生理生化反應來發揮作用的。

3 討論

對于植物細胞質雄性不育的機理研究，國內外已有大量報道。本研究獲得的一些差異表達ESTs片段的功能蛋白分析結果，如細胞質磷酸葡糖變位酶、ATP合酶β亞基、熱激蛋白70、抗壞血酸過氧化物酶、蛋白激酶C等，對于辣椒CMS的成因，也具有一定的研究意義。

細胞質磷酸葡糖變位酶(phosphoglucomutase，PGM)是一種催化磷酸酰基從1-磷酸葡萄糖的C-1轉移至C-6生成6-磷酸葡萄糖的酶，在高等植物中以質體型PGM和胞質型PGM 2種同工酶的形式存在。其中質體型PGM是參與植株淀粉合成的關鍵酶之一，缺乏質體型PGM活性的擬南芥和煙草突變株將無法積累淀粉。本研究中PGM在保持系文庫中出現，說明其在不育系中是下調表達，推測它的不足可能使得不育系花粉細胞缺少淀粉積累，無法正常發育而導致敗育。

ATP合成酶廣泛存在于葉綠體、線粒體中，是生物能量轉換的核心酶，參與氧化磷酸化和光合磷酸化過程，催化ATP生成。有研究表明，玉米和高粱保持系花藥中的ATP含量遠高于不育系。鑒于ATP合酶B亞基的相關序列在保持系文庫中被富集出來，推測不育系因缺乏ATP合成酶，導致花粉細胞缺少能量供應而敗育。

熱激蛋白(heat shock proteins，HSPs)又稱為熱休克蛋白或應激蛋白，是生物體受到高溫、缺氧、鹽漬、干旱等不良環境因素影響時誘導合成出的一類應激蛋白。熱激蛋白70(HSP70)是熱激蛋白家族中重要的一種，與HSP27、HSP60等一起作為分子伴侶影響蛋白質的裝配、運輸和折疊，從而直接影響凋亡信號轉導通路，在細胞生存和死亡的動態平衡中起著關鍵性的調節作用。有研究發現，高粱不育系中的HSPTO基因轉錄受阻，使得細胞的減數分裂不能正常進行，致使花藥細胞的線粒體數量比可育系減少了72.1％，花粉發育得不到足夠的能量供應而導致花粉敗育。本研究得到1條HSP70蛋白相關EST序列，推測由于其在保持系中的正常表達，使得花粉細胞發育良好，從而維持了保持系的正常育性。

抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate Deroxidase.APX)是高等植物中一種以抗壞血酸為電子供體的專一性很強的過氧化物酶。它可以催化植物體中有害的過氧化氫與抗壞血酸反應生成水，幫助清除細胞中致命的活性氧類物質。Mittler等在病毒誘導煙草細胞程序化死亡的試驗中發現細胞質中的APX活性下降：Jiang等認為哈克尼西棉細胞質雄性不育是一種細胞程序化死亡，該程序化死亡是由線粒體基因突變引導活性氧積累，傷害花粉母細胞造成的，是花粉母細胞對活性氧積累的過敏反應；Li等對水稻紅蓮型雄性不育系的研究發現，水稻CMS的小孢子母細胞在發育過程中遭受到活性氧傷害，引起細胞程序化死亡而導致花粉敗育。本研究根據以上報道和試驗結果，推測辣椒CMS不育系的花粉母細胞也可能由于缺乏APX而引起活性氧累積，使得細胞死亡而敗育。

Ca²⁺是真核生物中普遍存在的第2信使，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)作為一種依賴于Ca²⁺和磷脂的蛋白激酶，參與細胞信號傳導，調節的細胞效應極為廣泛。田翠婷㈣在青桿中的研究表明，PKC通過調節質膜Ca²⁺通道活性，參與維持花粉管Ca²⁺賴以生存的梯度：并通過磷酸化微絲結合蛋白、調節微絲骨架組裝來保證分泌系統的正常運轉和細胞壁的構建，在青桿花粉萌發、花粉管極性生長中起著重要作用。因而推測蛋白激酶C在辣椒保持系中可能參與Ca²⁺調節，保證了花粉的正常萌發和花粉管的正常伸長。

4 結論

本研究以辣椒細胞質雄性不育系與相應的保持系為材料，利用抑制差減雜交技術手段，篩選出26條具有同源比對結果的差異表達基因片段，其功能涉及基礎代謝、脅迫應答、信號傳導等細胞生命活動的多個方面；試驗中還分離到一些功能未知基因，其功能有待于進一步深入研究。