甜瓜屬REMAP分子標記體系的建立及應用

摘要：基于甜瓜屬Ty1-copra類逆轉座子的長末端重復序列信息，結合ISSR引物序列，在體系優化的基礎上建立了適用于甜瓜屬物種的REMAP(retrotransposon-一microsatellite amplified polymorphism)標記體系。對46份甜瓜屬不同類型材料進行聚類分析，證明該標記體系能有效檢測甜瓜屬不同類型材料問的多態性，可以用于甜瓜屬作物品種鑒定及指紋圖譜構建。

關鍵詞：甜瓜屬；分子標記；REMAP；多態性

逆轉座子(retrotrarsposon)是高等植物中種類最多、分布最廣的一類可移動因子，其轉座過程以RNA為中間媒介，通過逆轉錄酶所主導的DNA-RNA-DNA方式轉座，每轉座1次，其拷貝數就增加1次，從而成為植物基因組的重要組成部分。根據是否具有長末端重復序列(long terminal repeat，LTR)可將其分為LTR和非LTR兩類。目前研究較多的是LTR類逆轉座子，是一類異質性很高的群體，以高拷貝數形式出現，廣泛存在于所有染色體中，在植物中表現出插入多態性。

逆轉座子因具有分布廣泛、高度異質性及拷貝數多等特性，使其成為研究植物遺傳多樣性和進化的理想工具。逆轉座子微衛星多態性標記(retro-transposon-microsatellite amplified polymorphism，REMAP)是基于逆轉座子LTR序列并結合ISSR開發的應用比較廣泛的標記之一。已有研究表明REMAP標記具有譜帶豐富、多態性高以及操作簡便等優點，在品種鑒定和遺傳多樣性分析方面具有廣泛的應用價值。

甜瓜屬包含甜瓜(Cucumis melo IJJ)和黃瓜(C.sativus L.)2種重要經濟作物，但其遺傳基礎狹窄，黃瓜栽培種間的多態性僅為3％-9％，進一步開發多種分子標記體系對于促進甜瓜屬植物基因組研究具有重要意義。筆者前期研究發現逆轉座子在黃瓜的基因組中分布廣泛，并且開發了SSAP標記。雖然SSAP標記能夠有效地揭示甜瓜屬不同材料間的遺傳多樣性，但是該標記體系基于酶切和PCR技術，對DNA質量要求較高，且操作步驟繁瑣，在一定程度上限制了其應用㈣。因此，進一步開發多態性高、操作簡單的標記體系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

選取來自不同地區、不同生態型的46份甜瓜屬材料，其中包括黃瓜近緣野生種C，hystrix及其與栽培黃瓜北京截頭雜交加倍后形成的異源四倍體新種C.hytivus(表1)。所用材料均為本實驗室多年自交保存資源。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取供試植株統一播種于溫室中，待植株長至第5片真葉時，取剛展開的新葉，采用CTAB法提取基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠顯色進行DNA濃度定量。

1.2.2 REMAP引物的設計與合成 REMAP標記體系的正、反向引物分別來源于Tyl-copia類逆轉座子的LTR序列和ISSR引物，其中Tyl-copia類逆轉座子序列信息來源于GenBank，登錄號為GQ326556，引物序列信息見表2。引物由上海英駿生物有限公司合成。

1.2.3 REMAP反應體系的建立前期通過調整反應體系中DNA模板量、Taq酶、Mg²⁺、dNTPs和引物等各成分的比例，優化擴增體系。確定REMAP標記的反應體系為：20μL反應體系中，10xbuffel-2.0mmol·L^-1、Mg²⁺2.0 mmol·L^-1、dNTPs 0.2 mmol-L^-1、Tao酶1.0 U、0.4 txm01，L^-1引物，模板DNA 50 ngPCR擴增反應在PTC-100 PCR儀上進行，擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸2 min.40個循環；循環結束后72℃延伸10min，4℃終止反應。

1.2.4 PCR產物檢測 1μL上樣緩沖液與6μL。PCR產物混合后，在2％瓊脂糖凝膠上以1xTAE緩沖液進行電泳，EB染色，在凝膠成像系統中采集圖像。1μL上樣緩沖液和3μLPCR產物混勻后，6％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測。

1.2.5 聚類分析對REMAP引物檢測結果分析，每條多態性條帶為1個數據統計條帶，并采用1(有帶)和0(無帶)的方法統計條帶，最后用NTSYSpc2.11軟件進行分析作圖。

2 結果與分析

2.1 REMAP聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

圖1顯示。46份甜瓜屬材料中共擴增出33條條帶，其中23份黃瓜材料擴增出22條條帶，其中14條為共有條帶，差異率為36.36％。這22條條帶大多集中于100-250bD；23份甜瓜材料擴增出的條帶數為33條，黃瓜材料中出現的22條條帶在甜瓜材料中仍都存在。各個甜瓜材料均得到14-28條條帶，其中11條為共有條帶，集中于100-750bp，表現差異率66.67％。聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示，甜瓜屬材料在100-750 bp擴增出26條多態性條帶，表明在REMAP標記擴增中產生了大量大小相近條帶，而這對于分辨率較低的瓊脂糖凝膠電泳而言，很難得到清晰詳盡的指紋圖譜。瓊脂糖凝膠電泳適合于一般的核酸檢測，但相對于擴增條帶較多的標記如REMAP，則需要分辨率更高的電泳。由此可見，為了得到更加準確的指紋圖譜，6％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳應優先選擇，這與Leigh等和王利英等的分析結果一致。

2.2 基于REMAP標記的甜瓜屬材料的聚類分析

根據REMAP分子標記引物LTRA-J1和LTRA-J2對材料的檢測結果進行統計分析，利用NTSYSpc2，11獲得甜瓜屬46份材料的聚類圖譜，將46份材料分為2個類群(圖2)。

第1類群包含27份材料，絕大多數為黃瓜材料，但還包含4份甜瓜材料。該標記能夠把遺傳距離狹窄的各個黃瓜材料區分開。該類群分為5個亞類，亞類A1含有ECl、EC5、PI 508454、北京截頭、黃瓜近緣野生種C.hystrix、黃瓜種間雜交種C.hytivus。其中黃瓜種間雜交種C.hytivus及其雙親北京截頭和黃瓜近緣野生種C.hystrix在分支樹中分在同一個分支中，表現出極近的親緣關系。亞類A2中有8份材料，包括PI 508455、二早子、平望、SWCCl0、PI436533、SWCC8、SWCCl2、SWCC9，其中4份西雙版納材料親緣關系表現出一定的相似度。在亞類A3中含有10份材料。大多為美國生態型及華北生態型材料。其余2個亞類A4和A5均為甜瓜材料，亞類A4共有2份材料，分別是來自南非的甜瓜PI374152和來自阿富汗的甜瓜PI 324525：亞類A5為俄羅斯甜瓜PI 476332。亞類A4、A5材料與黃瓜有著較近的親緣關系，

第Ⅱ類群全部為甜瓜材料，分為8個亞類，相互間遺傳距離較遠，可以清晰地分辨出各個甜瓜材料。亞類B1含有意大利甜瓜PI 136170、加拿大甜瓜PI136229和贊比亞甜瓜PI 500362。亞類B2中，親緣關系較近的2個中國甜瓜，現在在中國仍然廣泛種植，另外2個埃及甜瓜在埃及普遍種植。亞類B3中包含1個埃及甜瓜PI 525115和1個贊比亞甜瓜PI249897。另外亞類B4-B8中材料較少，與其他甜瓜材料親緣關系也較遠。對甜瓜材料聚類分析后發現，甜瓜材料較黃瓜材料相互間親緣關系較遠，遺傳變化較大。

3 討論

根據rrvl-copia類逆轉座子的LTR序列設計引物，與ISSR引物組合成REMAP分子標記，建立了適合于甜瓜屬材料的REMAP分子標記體系，并應用于甜瓜屬不同類型材料間的遺傳多樣性分析。在前期瓊脂糖電泳中檢測的條帶數量遠遠低于聚丙烯酰胺凝膠電泳中檢測的數量。REMAP擴增出的譜帶在100-750 bp較為集中，弱帶較多，根據不同檢測方式的比較，認為高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳應優先選擇，

為了闡明REMAP擴增譜帶的來源，與ISSR單引物的擴增結果進行了比較。試驗結果表明，單ISSR引物擴增產物與REMAP標記的擴增產物差別較大。ISSR引物擴增條帶主要集中于250-2 000bp，而REMAP標記擴增條帶集中于100-750 bp。同時從擴增條帶數目來看，ISSR引物在黃瓜材料中共擴增出7條條帶，甜瓜材料中擴增出9條條帶，遠遠低于REMAP標記的33條條帶。證明REMAP擴增圖譜的來源主要是逆轉座子和ISSR引物共同作用的結果。

逆轉座子標記較常規標記具有靈敏度高、基因組覆蓋度廣和多態性豐富等特點，尤其適用于種質鑒定、遺傳多樣性及系統發育分析。筆者利用2對REMAP引物對甜瓜屬46份材料進行聚類分析，成功將甜瓜屬材料分成2個類群、13個亞類，能夠有效區分黃瓜材料和甜瓜材料。其中類群1分為5個亞類，相互間遺傳差異率較小，說明了黃瓜材料的遺傳變異狹窄。類群Ⅱ分為8個亞類，遺傳距離遠，甜瓜材料表現出較大的遺傳變異。聚類分析表明建立的REMAP分子標記體系可以有效地用于甜瓜屬材料的遺傳多樣性分析。

4 結論

本試驗在前期體系優化的基礎上建立了適用于甜瓜屬材料的REMAP分子標記體系，并通過不同的檢測方法比較，確定聚丙酰胺凝膠電泳應優先進擇。通過REMAP分子標記體系和ISSR分子標記體系的比較，證實了REMAP譜帶是逆轉座子和微衛星序列共同作用的結果，并將開發的REMAP標記體系應用于46份甜瓜屬材料的遺傳多樣性分析。建立的甜瓜屬REMAP分子標記體系，對進一步開展甜瓜屬相關分子生物學研究，如建立高密度遺傳圖譜、重要目標性狀定位、生物多樣性與系統進化研究等具有重要意義。