噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)肺泡灌洗液結(jié)核分枝桿菌的臨床研究

【摘要】目的:探討噬菌體生物擴(kuò)增法(phaB)檢測(cè)肺泡灌洗液中結(jié)核分枝桿菌的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法:收集疑診為肺結(jié)核，未予抗結(jié)核的初治患者肺泡灌洗液標(biāo)本80例，同時(shí)應(yīng)用PhaB法、熒光涂片法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)法(PCR檢測(cè)法)、羅氏培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)照分析檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果:80例患者纖支鏡檢查有46例發(fā)現(xiàn)異常，使用PhaB法、熒光涂片法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、羅氏培養(yǎng)法檢查陽(yáng)性率分別為58.8%、47.5%、65%、76.3%;PhaB法和聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)兩種方法聯(lián)合檢測(cè)敏感性為88.5%，特異性為89.5%。結(jié)論:PhaB檢測(cè)疑診為肺結(jié)核的未予抗結(jié)核患者肺泡灌洗液結(jié)核分枝桿菌，有較高的敏感性和特異性，聯(lián)合熒光涂片法和聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)可進(jìn)一步提高其敏感性。

【關(guān)鍵詞】噬菌體生物擴(kuò)增法;聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù);結(jié)核;分枝桿菌

【中圖分類(lèi)號(hào)】R378.91+1【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2010)16-159-2

結(jié)核分枝桿菌感染人體而引發(fā)的結(jié)核病是全球性的嚴(yán)重危害人類(lèi)的傳染性疾病之一。我國(guó)作為發(fā)展中國(guó)家，結(jié)核病的控制更是任重道遠(yuǎn)。在結(jié)核病控制中，尋求經(jīng)濟(jì)，快速，敏感性和特異性較高的結(jié)核菌檢測(cè)方法，為結(jié)核的早期診斷提供依據(jù)是眾多臨床醫(yī)師所希望。目前痰熒光涂片靈敏度較差，并受痰樣本數(shù)和病情的影響，一般認(rèn)為活動(dòng)性肺結(jié)核涂陽(yáng)率約40-50%[1];羅氏培養(yǎng)法陽(yáng)性率較高約50-80%[1]，但需要平均時(shí)間約4-8周。本研究通過(guò)PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測(cè)法、羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)肺泡灌洗液中結(jié)核分枝桿菌，通過(guò)對(duì)照評(píng)價(jià)PhaB法在肺結(jié)核診斷中的使用價(jià)值及優(yōu)缺點(diǎn)。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2008-2010年廣州市胸科醫(yī)院疑診初治肺結(jié)核住院患者80例，其中男性35例，女性25例，年齡19～65歲，平均年齡38.5±7.5歲。入選條件:疑診為初治肺結(jié)核并支氣管結(jié)核，未開(kāi)始抗結(jié)核治療;三個(gè)月內(nèi)未接受喹諾酮類(lèi)和氨基糖甙類(lèi)抗生素治療。

1.2方法

1.2.1PhaB法結(jié)核分枝桿菌噬菌體生物擴(kuò)增試劑盒(FAST plaue TB)由英國(guó)BDTEC公司生產(chǎn)，由上海市金浩科技發(fā)展有限公司提供。

1.2.2支氣管沖洗液標(biāo)本收集按支氣管鏡檢查常規(guī)進(jìn)行術(shù)前準(zhǔn)備和麻醉，通過(guò)胸部CT或胸片初步確定重點(diǎn)檢查部位。氣管鏡經(jīng)鼻腔進(jìn)入，通過(guò)聲門(mén)逐步檢查氣管，支氣管。對(duì)鏡下可見(jiàn)病變部位，可先后進(jìn)行支氣管粘膜活檢和支氣管刷檢，隨后進(jìn)行支氣管沖洗，將生理鹽水5～10毫升注入相應(yīng)的肺葉和肺段病變部位進(jìn)行沖洗，用吸引器將沖洗液收集入標(biāo)本瓶中送檢，共2-3次。對(duì)鏡下病變部位不明顯處，將纖支鏡插入病灶最多部位所在的支氣管開(kāi)口按上述方法進(jìn)行刷檢、沖洗，留取標(biāo)本。

1.2.3噬菌體生物擴(kuò)增法按試劑盒(FASTPlaqueTBTM)說(shuō)明書(shū)配制所需試劑，包括培養(yǎng)基-生物添加劑、瓊脂、噬菌體和敏感細(xì)胞等，全部操作在無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行。肺泡灌洗液洗標(biāo)本的處理:取灌洗液標(biāo)本5ml，加入1倍體積的4%NAOH溶液混勻常溫靜置15min去污染。加入磷酸緩沖液(PH6.8)離心20min，棄去上清液。重懸沉淀物，4000g離心15min，棄去上清液，重懸沉淀物，無(wú)菌條件下吸取1ml重懸液加入孵育管中，37℃孵育24小時(shí)。檢測(cè):每次取1ml處理后的樣品加入各反應(yīng)管中，陰性對(duì)照不加標(biāo)本，陽(yáng)性對(duì)照加入1:1000稀釋度的敏感細(xì)胞液。加入100ul噬菌體溶液在37℃條件下培育1h。在每個(gè)反應(yīng)管中加入100ul強(qiáng)效殺毒劑溶液，上下充分混勻，室溫放置5min后加入5ml培養(yǎng)基-生長(zhǎng)添加劑和1ml敏感細(xì)胞液。將反應(yīng)管中所有反應(yīng)混合物倒入培養(yǎng)皿中，加入5ml融化的瓊脂，快速混勻靜置成型。37℃溫育18-24小時(shí)后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷:噬菌斑數(shù)≦19個(gè)陰性，≧20個(gè)位陽(yáng)性。

1.2.4其他檢測(cè)方法熒光涂片法:用金胺“O”熒光染色涂片法，熒光顯微鏡檢每50個(gè)視野≥10-99條抗酸桿菌為陽(yáng)性;結(jié)核菌培養(yǎng):用BacT/Alert3D全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)儀按照儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行臨床標(biāo)本的分離培養(yǎng);熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR檢測(cè)):檢測(cè)沖洗液結(jié)核分枝桿菌DNA片段，TB-DNA基因拷貝數(shù)量>1×103拷貝/mL陽(yáng)性

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，用X2檢驗(yàn)比較不同檢測(cè)方法的陽(yáng)性率，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義。

2結(jié)果

初步診斷為肺結(jié)核合并支氣管內(nèi)膜結(jié)核的，未予抗癆治療的纖支鏡肺泡灌洗液標(biāo)本80例。使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測(cè)法、羅氏培養(yǎng)法四種檢測(cè)方法，PhaB法陽(yáng)性率58.8%，熒光涂片法陽(yáng)性率為47.5%，PCR檢測(cè)法陽(yáng)性率65%，快速培養(yǎng)法陽(yáng)性率76.3%。其中，PhaB法檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于熒光涂片法，檢驗(yàn)差異有顯著性意義(X2=4.27，P<0.05);PhaB法和聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)法檢出率無(wú)顯著性差異(X2=1.78，P>0.05)，提示兩者陽(yáng)性檢出率類(lèi)似;PhaB法與羅氏培養(yǎng)法比較檢驗(yàn)有顯著性差異(X2=12.07，P<0.05)，提示對(duì)比羅氏培養(yǎng)法PhaB法陽(yáng)性檢出率稍差。聯(lián)合①②③陽(yáng)性檢出率為82.5%和④比較(X2=0.09，P>0.05)。

表一 80例初步診斷肺結(jié)核肺泡灌洗液使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測(cè)法、羅氏培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果

方法標(biāo)本例數(shù)陽(yáng)性例數(shù)陽(yáng)性檢出率(%)

①PhaB法804758.8

②熒光涂片法803847.5

③PCR檢測(cè)805265

①③兩種方法聯(lián)合805872.5

④羅氏培養(yǎng)法806176.3

PhaB法檢出的47份陽(yáng)性標(biāo)本中，熒光涂片法檢出35例陽(yáng)性;PhaB法檢出的33份陰性標(biāo)本中，熒光涂片法檢出30例陰性。PCR法檢測(cè)的52份陽(yáng)性標(biāo)本中，PhaB法檢出41份，檢出率78.8%;羅氏培養(yǎng)法陽(yáng)性的61例標(biāo)本中，PhaB法檢測(cè)出44份，檢出率72.1%。

表二 80例初步診斷肺結(jié)核肺泡灌洗液使用PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測(cè)法、羅氏培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果比較

熒光涂片法PCR檢測(cè)法羅氏培養(yǎng)法

陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性

PhaB法陽(yáng)性(n=47)3512452470

陰性(n=33)3307261419

合計(jì)384252286119

3討論

1997年wilson等[2]人發(fā)現(xiàn)眾多的噬菌體中有一種分枝桿菌噬菌體能感染結(jié)核分枝桿菌和少數(shù)幾種非結(jié)核分枝桿菌。在經(jīng)過(guò)處理的標(biāo)本中加入結(jié)核分枝桿菌噬菌體，使噬菌體和分枝桿菌結(jié)合，隨后加入殺毒劑滅活未感染分枝桿菌的噬菌體。噬菌體在受感染的分枝桿菌內(nèi)，利用其代謝酶系進(jìn)行大量繁殖。當(dāng)分枝桿菌破裂，大量的子代噬菌體被釋放，感染加入的敏感指示細(xì)菌，在培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)形成噬菌體空斑。當(dāng)空斑數(shù)量>20個(gè)為陽(yáng)性，否則為陰性。陽(yáng)性的標(biāo)本間接提示原標(biāo)本有結(jié)核分枝桿菌或少數(shù)的幾種非結(jié)核分枝桿菌。這構(gòu)成了噬菌體法檢測(cè)分枝桿菌的理論基礎(chǔ)[3]。據(jù)國(guó)外資料報(bào)道，2002年南非Albert[4]等人對(duì)疑似肺結(jié)核患者，以羅氏培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，噬菌體法對(duì)痰標(biāo)本檢測(cè)的敏感性73%，特異性為99%;巴基斯坦Muzaffar[5]等人用類(lèi)似方法測(cè)得噬菌體法的敏感性82%，特異性98%;國(guó)內(nèi)于秀麗[6]等人用BACTEC MGIT980快速培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得噬菌體法檢測(cè)痰中結(jié)核分枝桿菌的敏感性為86.4%，特異性83.9%。均顯示噬菌體法對(duì)痰中分枝桿菌檢測(cè)有較高的敏感性和特異性。

本研究用噬菌體生物擴(kuò)增法、熒光涂片法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、羅氏培養(yǎng)法共4種方法同時(shí)檢測(cè)不同的纖支鏡肺泡灌洗液標(biāo)本80份。PhaB法、熒光涂片法、PCR檢測(cè)法、羅氏培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出率分別為58.8%，47.5%，65%，76.3%。PhaB法和熒光涂片法陽(yáng)性率比較，差異有顯著性意義(X2=4.27，P<0.05)，說(shuō)明PhaB法比熒光涂片法有更高的敏感性。國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。PhaB法和PCR檢測(cè)法陽(yáng)性檢出率比較無(wú)顯著性差異(X2=1.78，P>0.05);噬菌體生物擴(kuò)增法以羅氏培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果提示其敏感性77%，特異性100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100%，陰性預(yù)測(cè)值57.6%。和國(guó)外以痰標(biāo)本PhaB法檢測(cè)報(bào)道結(jié)果相似[4]。聯(lián)合PhaB法和熒光涂片法檢測(cè)敏感性為81.2%，特異性為100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100%，陰性預(yù)測(cè)值57.6%;聯(lián)合PhaB法和PCR檢測(cè)法檢測(cè)敏感性為88.5%，特異性為89.5%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值96.3%，陰性預(yù)測(cè)值89.5%。提示聯(lián)合PhaB法和PCR檢測(cè)法，能快速診斷肺結(jié)核，有較高的敏感性和特異性，在臨床中可能有較大的實(shí)用價(jià)值。這有待于更大的標(biāo)本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌學(xué)檢測(cè)是診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)之一，但患者排菌情況受結(jié)核病發(fā)現(xiàn)時(shí)期較大影響，對(duì)早期以滲出、增殖為主的病理改變，排菌量較小;而發(fā)生壞死，空洞形成的患者相對(duì)排菌量較大。同時(shí)病灶相連的支氣管引流是否通暢也影響遠(yuǎn)端氣管內(nèi)分泌物的排出，影響到痰結(jié)核菌的檢查。本組病例肺泡灌洗液標(biāo)本PhaB法陽(yáng)性檢測(cè)率較高，除了與病例的選擇有關(guān)，考慮原因:支氣管鏡檢查對(duì)支氣管、肺泡的機(jī)械性刺激，活檢鉗和毛刷損傷支氣管壁和病灶邊緣，同時(shí)在在纖支鏡活檢和刷檢后灌洗可起到疏通支氣管，促進(jìn)遠(yuǎn)端分泌物的排出。用生理鹽水在病變部位注入遠(yuǎn)端氣道和肺實(shí)質(zhì)，接觸病灶范圍較廣，負(fù)壓吸引收集沖洗液較多，細(xì)菌量較大，深部的結(jié)核菌可能被收集到?jīng)_洗液中。肺泡灌洗液對(duì)支氣管有刺激作用，可以誘發(fā)部分患者咳嗽，有利于深部結(jié)核菌的排出，獲得結(jié)核菌的機(jī)會(huì)增多[7]。另外，PhaB法是通過(guò)噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌，而結(jié)核分枝桿菌受一些理化因素作用，表面受體發(fā)生細(xì)微變化可能導(dǎo)致不能被噬菌體感染[8]。相對(duì)痰標(biāo)本，肺泡灌洗液標(biāo)本受理化因素影響較小。

總結(jié)噬菌體生物擴(kuò)增法對(duì)肺泡灌洗液標(biāo)本分枝桿菌檢測(cè)的臨床應(yīng)用。PhaB法操作簡(jiǎn)便，獲取結(jié)果快速(2天)，相對(duì)熒光涂片法有較高的敏感性和特異性。對(duì)PhaB法分枝桿菌檢測(cè)高特異性，臨床可以用于結(jié)核桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定[9]。針對(duì)噬菌體必須感染活的結(jié)核菌特性，臨床中還可以對(duì)標(biāo)本加入不同的結(jié)核藥，對(duì)照不加藥標(biāo)本，篩查結(jié)核菌株對(duì)不同結(jié)核藥的耐藥性[2]。

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