反相高效液相色潽法測定復(fù)方養(yǎng)陰生肌散中龍膽苦苷含量的研究

【摘要】目的:建立反相高效液相色譜法測定養(yǎng)陰生肌散中龍膽苦苷的含量。方法:色譜柱:Aglient XDB-C18(250*4.6mm);流動(dòng)相:水-乙腈(80:20);流速:1.0ml﹒min-1;檢測波長:254nm。結(jié)果:龍膽苦苷在20～110ug﹒ml-1范圍里線性關(guān)系良好，平均回收率為98.10%，符合分析要求。結(jié)論:所建方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法;復(fù)方養(yǎng)陰生肌散;龍膽苦苷

【中圖分類號(hào)】R927.2【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2010)16-017-2

復(fù)方養(yǎng)陰生肌散是由青黛、龍膽草、黃柏、薄荷、甘草等多味中藥組成的復(fù)方制劑。由于成分復(fù)雜，各味藥的含量均不是很高，有效成分濃度相對(duì)較低，傳統(tǒng)的TLC法定量分析難以達(dá)到準(zhǔn)確分析，誤差太大，很難達(dá)到定量分析的目的，因此，有必要?jiǎng)?chuàng)建HPLC法測定其主要含量。龍膽草是處方主要組成部分，其指標(biāo)成分龍膽苦苷(Gentiopicrin)不僅性質(zhì)穩(wěn)定且單味藥的提取率高，因此建立復(fù)方養(yǎng)陰生肌散中龍膽苦苷的高效液相色譜法，可用于檢測處方藥的提取工藝，監(jiān)控復(fù)方養(yǎng)陰生肌散的制劑質(zhì)量。方法簡便、迅速、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

1儀器與試藥

Aglient 1100高效液相色譜儀;Aglient紫外檢測器;KQ2200型超聲波清洗儀;TGL-16C型離心機(jī);減壓真空干燥器。

龍膽苦苷對(duì)照品由中國藥品生物制品檢定所提供(批號(hào):11070-200810);乙腈為色譜醇;水為重蒸水;所用其它試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱:Aglient XDB-C18(250*4.6mm);流動(dòng)相:水-乙腈(80:20);流速1.0ml﹒min-1;檢測波長:254nm;進(jìn)樣量:10μl;柱溫:25.0℃;外標(biāo)法。理論塔板數(shù)按龍膽苦苷峰計(jì)算不得低于3500。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液

取龍膽苦苷對(duì)照品置五氧化二磷減壓干燥器中放置12小時(shí)以上，精密稱定，用甲醇配制成濃度為0.8mg﹒ml-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液

取本品約1.84g，精密稱定，置50ml燒杯中，加甲醇適量，超聲10min，放至室溫，過濾到25ml的容量瓶中，再用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻。再精密移取上述溶液8ml至25ml容量瓶，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液

取除龍膽草外處方中其它藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3專屬性實(shí)驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，記錄色譜圖。結(jié)果供試品與對(duì)照品溶液均在相同保留時(shí)間出現(xiàn)吸收峰，空白溶液在此處無吸收峰，即本試驗(yàn)條件下龍膽苦苷與其它組分分離完全。結(jié)果見圖1。

2.4線性關(guān)系考察

取龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，制備濃度為0.41mg﹒ml-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml分別置10ml容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，依次進(jìn)樣10μl，記錄峰面積。以濃度-峰面積進(jìn)行回歸，所得線性方程為:y=12519x+23859，相關(guān)系數(shù):r=0.9998(n=5)，結(jié)果表明龍膽苦苷在20～110ug﹒ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 養(yǎng)陰生肌散龍膽苦苷專屬性考察

A-陰性溶液;B-供試品溶液;C-龍膽苦苷對(duì)照品溶液

2.5精密度試驗(yàn)

精密吸取同一濃度龍膽苦苷對(duì)照品溶液(82ug﹒ml-1)，重復(fù)進(jìn)樣7次，進(jìn)樣量10μl，以龍膽苦苷峰面積計(jì)算，RSD為0.89%(n=7)。結(jié)果表明，精密度較好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同批樣品粉末6份，精密稱定。按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。計(jì)算樣品中龍膽苦苷含量，結(jié)果RSD為1.25%。結(jié)果表明，重復(fù)性較好。

2.7加樣回收試驗(yàn)

采用加樣回收法，取樣品適量，精密稱定，分別精密加入已知含量的低、中、高濃度的龍膽苦苷對(duì)照品，按“2.1”“2.2”項(xiàng)方法操作，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收率測定結(jié)果

測得量 (ug)加入量標(biāo)準(zhǔn)品(ug)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)

77.0178.6897.8898.100.41

76.3778.6897.06

77.378.6898.25

102.92104.9198.11

103.08104.9198.26

102.55104.9197.75

118.86120.6598.52

119.07120.6598.69

118.68120.6598.37

2.8樣品測定

取三批樣品。按“2.2”項(xiàng)方法制樣，按“2.1”項(xiàng)條件操作，計(jì)算三批樣品中龍膽苦苷的平均含量為0.63%，RSD=1.58%。

3討論

3.1檢測波長的選取龍膽苦苷的最大吸收波長在274nm處，當(dāng)采用274nm為檢測波長時(shí)，檢測靈敏度較高，但相應(yīng)雜峰增多，基線不平穩(wěn)，分離度較差，當(dāng)采用254nm為檢測波長時(shí)，基線平穩(wěn)，分離度好。此外在254nm處同一流動(dòng)相下還可以檢測到處方中另外一味藥的有效成分，而且兩中成分的呈基線分離。因此，選取254nm作為檢測波長。

3.2含量測定時(shí)對(duì)提取溶劑和提取方法做了正交試驗(yàn)考察，結(jié)果甲醇超聲提取時(shí)干擾最少，含量最高。對(duì)不同的流動(dòng)相及同種流動(dòng)相的不同比例進(jìn)行考察，結(jié)果流動(dòng)相為乙腈-水(20-80)時(shí)，峰高、分離度和理論塔板數(shù)都比較好且基線平穩(wěn)。此外，用乙腈-水(20-80)作流動(dòng)相還可以在同一檢測波長下分離復(fù)方中藥中的另外一味有效成分。

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