CD4+CD25+\\CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+ T淋巴細(xì)胞的晝夜節(jié)律性變化

【摘要】目的:探討CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞的晝夜節(jié)律性變化情況。方法:10名健康男性志愿者，年齡24～30歲，平均25歲。預(yù)先在晝夜節(jié)律模式條件(16h-light:8h-dark cycle，LD)下生活1周:室溫25±1ordm;C，起床時(shí)間:7:00，睡眠時(shí)間(無光照期):23:00～7:00，早餐時(shí)間:7:30～8:00，午餐時(shí)間:11:30～12:00，晚餐時(shí)間:5:00～6:00;睡眠時(shí)光照強(qiáng)度<0.1 Lux;受試者自由飲水，無煙酒嗜好，日常活動(dòng)和飲食成分基本一致。隨后在一晝夜內(nèi)每隔4h抽取各受試者外周血3ml，用流式細(xì)胞儀測定CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比，通過余弦法和Clock Lab軟件獲取節(jié)律參數(shù)，并經(jīng)振幅檢驗(yàn)分析是否存在晝夜節(jié)律。結(jié)果:在自然光制下，CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量均呈現(xiàn)晝高夜低的節(jié)律性振蕩(P<0.05)，但各細(xì)胞相對(duì)數(shù)量變化的峰谷時(shí)點(diǎn)略有不同。結(jié)論:人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞的變化均存在著晝夜節(jié)律性特征。

【關(guān)鍵詞】CD4;CD25;CD69;HLA-DR;晝夜節(jié)律;T細(xì)胞

【中圖分類號(hào)】R331.1+44【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2010)16-074-2

晝夜節(jié)律生物鐘是一種普遍的生物活動(dòng)現(xiàn)象。哺乳類動(dòng)物的生物鐘已被定位于下丘腦前部的視交叉上核(suprachias

-matic nucleus，SCN)和松果體[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)的組成和功能，如免疫細(xì)胞數(shù)量、免疫球蛋白的濃度、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)等都存在晝夜節(jié)律性變化[2]。CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞是一類已活化的免疫細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中起著重要的作用[3]。對(duì)于這些活化的T淋巴細(xì)胞的晝夜節(jié)律性的表達(dá)，到目前為止，研究報(bào)道并不多。本實(shí)驗(yàn)在模擬自然光制條件下，測定不同晝夜時(shí)點(diǎn)外周血中CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的變化，以確定其是否存在晝夜節(jié)律特征。

1材料和方法

1.1研究對(duì)象與造模

10名健康男性志愿者，年齡24～30歲，平均25歲;既往身體健康，無感染性和自身免疫性疾病，在過去6個(gè)月內(nèi)未做過跨時(shí)區(qū)旅行和未接受過藥物治療。預(yù)先在實(shí)驗(yàn)室晝夜節(jié)律模式條件(自然光制，16h-light:8h-darkcycle，LD)下生活1周:室溫25±1ordm;C，起床時(shí)間:7:00，睡眠時(shí)間(無光照期):23:00～7:00，早餐時(shí)間:7:30～8:00，午餐時(shí)間:11:30～12:00，晚餐時(shí)間:5:00～6:00;睡眠時(shí)光照強(qiáng)度<0.1Lux;受試者自由飲水，無煙酒嗜好，日常活動(dòng)和飲食成分基本一致。

1.2樣品采樣

將外界自然光照起點(diǎn)時(shí)間設(shè)定為晝夜0時(shí)點(diǎn)(自然時(shí)間凌晨5時(shí))，把24h自然時(shí)點(diǎn)轉(zhuǎn)換成晝夜時(shí)點(diǎn)(zeitgeber time，ZT)。受試者在實(shí)驗(yàn)室生活1周后，在一晝夜內(nèi)每隔4h按不同晝夜時(shí)點(diǎn)(ZT02、06、10、14、18、22，n=6)分別采集其外周靜脈血，每份取樣3ml，每組(每個(gè)時(shí)點(diǎn))n=10，肝素抗凝后立即于流式細(xì)胞儀檢測三種細(xì)胞的百分比。

1.3儀器與試劑

Epics XL#8226;MCL流式細(xì)胞分析儀，美國Beckman Coulter公司;CD4單克隆抗體(FITC標(biāo)記)，CD25單克隆抗體(PE標(biāo)記)，CD69單克隆抗體(PC5標(biāo)記)，HLA-DR單克隆抗體(PE標(biāo)記)，美國Beckman Coulter公司;溶血素(1.5% Formaldehyde)，美國Beckman Coulter公司;PBS緩沖液，自制。

1.4流式細(xì)胞分析

取兩根試管，一管加CD4單克隆抗體10μl、CD69單克隆抗體4μl和CD25單克隆抗體10μl到小試管底部，第二管加CD4、HLA-DR單克隆抗體各10μl到小試管底部(不要沾壁)。各吸取50μl肝素抗凝的外周血到小試管中，避免懸液沾到試管壁。充分混勻，室溫下避光放置15min。加入2501μl溶血素，振蕩混勻后置37℃水浴15min。加入2501μlPBS緩沖液振蕩混勻后置37℃水浴15min。加入1mlPBS緩沖液振蕩混勻后1800r/min離心5min，棄上清液，用濾紙吸干管壁，加入250μlPBS緩沖液，振蕩混勻備用。流式細(xì)胞儀進(jìn)行光路質(zhì)量調(diào)控和雙色熒光補(bǔ)償，以前向角FSLIN與側(cè)向角SSLIN取淋巴細(xì)胞設(shè)門，用流式細(xì)胞儀分析50000個(gè)細(xì)胞應(yīng)用配套分析軟件獲取CD4/CD25、CD4/CD69、CD4/HLA-DR雙陽性細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比。每批測定時(shí)，以空白管調(diào)整零點(diǎn)。

1.5數(shù)據(jù)處理

用余弦分析軟件和Clock Lab軟件獲取晝夜節(jié)律性參數(shù)，并經(jīng)振幅F檢驗(yàn)確定靶細(xì)胞晝夜節(jié)律性表達(dá)的變化。用于擬合的余弦函數(shù)方程為:F(t)=M+Acos(ωt+Φ)，其中M(mesor)為中值，即漲落變化的中線;A(amplitude)為節(jié)律振蕩的振幅，表示向上或向下波動(dòng)的幅度;Φ(peak phase or acrophase)為峰值相位，是振蕩達(dá)到峰值的時(shí)刻，可根據(jù)ω角速度(360°/24h)將其換算成各ZT時(shí)點(diǎn)。數(shù)據(jù)采用mean±SD表示，組內(nèi)差異用SPSS17.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn);組間差異用相同軟件包進(jìn)行方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異具有顯著性。

2結(jié)果

在LD(16:8)光制下的不同晝夜時(shí)點(diǎn)，以CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞百分比作為相對(duì)數(shù)量變化水平，各細(xì)胞的晝夜節(jié)律性變化反映于表1;對(duì)各晝夜時(shí)點(diǎn)變化的數(shù)據(jù)進(jìn)行余弦函數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)這三種細(xì)胞均具有明顯的晝夜節(jié)律性變化(振幅F檢驗(yàn)，P<0.05)。

表1 在 LD(16:8)光制下，人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD4+HLA-DR+T細(xì)胞各晝夜時(shí)點(diǎn)表達(dá)的變化

LD(16:8)光制下人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞變化的晝夜節(jié)律性參數(shù)反映于表2，CD4+CD25+T細(xì)胞百分比的峰值和谷值時(shí)間分別位于ZT19和ZT7，CD4+CD69+T細(xì)胞百分比的峰值和谷值時(shí)間分別位于ZT13和ZT1，CD4+HLA-DR+T細(xì)胞百分比的峰值和谷值時(shí)間分別位于ZT13和ZT1。

表2 在LD(16:8)光制下，人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD4+HLA-DR+T細(xì)胞表達(dá)的晝夜節(jié)律參數(shù)

LD(16:8)光制下，人外周血CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞晝夜節(jié)律性變化的時(shí)間外觀趨勢(shì)和經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線呈現(xiàn)于圖1。CD4+CD69+T淋巴細(xì)胞晝夜節(jié)律性變化的時(shí)間外觀趨勢(shì)和經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線呈現(xiàn)于圖2。CD4+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞晝夜節(jié)律性變化的時(shí)間外觀趨勢(shì)和經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線呈現(xiàn)于圖3。

圖1CD4+CD25+ T細(xì)胞變化的時(shí)間外觀趨勢(shì)圖(左)，經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線(右)。

圖2CD4+CD69+ T細(xì)胞變化的時(shí)間外觀趨勢(shì)圖(左)，經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線(右)。

圖3CD4+HLA-DR+ T細(xì)胞變化的時(shí)間外觀趨勢(shì)圖(左)，經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線(右)。

3討論

人們很早以來就知道生物體的活動(dòng)具有節(jié)律性，這是生物體為了更好適應(yīng)環(huán)境要求而發(fā)生的反應(yīng)。其中晝夜節(jié)律是最為重要的一種生物節(jié)律。近年來時(shí)間免疫學(xué)[4]的研究表明，動(dòng)物和人的免疫系統(tǒng)也具有多種顯性節(jié)律。目前，研究人員對(duì)免疫系統(tǒng)的節(jié)律性研究較多的是針對(duì)免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子的數(shù)量和功能。CD25、CD69和HLA-DR是免疫細(xì)胞活化時(shí)特有的表達(dá)分子。活化的淋巴細(xì)胞才是淋巴系統(tǒng)的功能細(xì)胞，因此，本研究著重從活化的T細(xì)胞的節(jié)律性變化著手研究，以探討這些活化的T細(xì)胞是否同樣具有晝夜節(jié)律性的變化。

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)LD(16:8)光制(即自然光制)條件下，正常成人6個(gè)不同晝夜時(shí)點(diǎn)采集的外周血標(biāo)本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)自然光制條件下人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞存在著晝夜節(jié)律性變化，三種細(xì)胞變化的節(jié)律振幅、中值和峰值相的水平并不相同，而其節(jié)律相位也略有不同。CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞峰值時(shí)間點(diǎn)位于晝夜時(shí)點(diǎn)的ZT19，谷值時(shí)間點(diǎn)位于ZT7。CD4+CD69+T淋巴細(xì)胞和CD4+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞峰值時(shí)間點(diǎn)均位于晝夜時(shí)點(diǎn)的ZT13，谷值時(shí)間點(diǎn)均位于ZT1。三種細(xì)胞中后兩者峰值時(shí)間點(diǎn)均早于前者，這可能是由于三種活化分子(CD25，CD69，HLA-DR)在T淋巴細(xì)胞活化時(shí)表達(dá)的早晚差異造成。

由于外周血淋巴細(xì)胞的數(shù)量本身存在著節(jié)律性的變化[5]，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)三種細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量進(jìn)行了研究，避免了因淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化而引起三種細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的改變。雖然研究人員很早就知道中樞核心晝夜節(jié)律調(diào)控組織主要定位于下丘腦前部的視交叉上核、松果體和視網(wǎng)膜。它通過神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控著人體的晝夜節(jié)律變化，但隨著對(duì)免疫系統(tǒng)晝夜節(jié)律研究的深入，我們已經(jīng)知道，免疫細(xì)胞中也存在著一些晝夜節(jié)律相關(guān)的基因，而且這些基因本身存在著節(jié)律性的變化，那么本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果到底是中樞核心晝夜節(jié)律調(diào)控組織發(fā)揮作用還是免疫系統(tǒng)中這些節(jié)律性基因在發(fā)揮調(diào)控作用卻有待于進(jìn)一步的探討。

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