新磺棕小兒止咳合劑微生物限度檢查方法的研究

陳德堅，黃春新，陳 萍，王 芳，林 蓉

（海南省人民醫院藥學部，海南 海口 570311）

新磺棕小兒止咳合劑是醫院的生產制劑，處方主要成分有磺胺甲噁唑、甲氧芐胺嘧啶、復方甘草合劑等。臨床上用于消炎、化痰、止咳，是兒科的常用制劑。根據2005年版《中國藥典》要求，具有抑菌活性的供試品，應消除供試品的抑菌活性后再依法檢查。本實驗通過中和法和薄膜過濾法消除供試品的抑菌活性后，用5株代表菌做微生物計數的菌回收率試驗及控制菌檢出率測定，探討該方法的可行性。現報道如下：

1 材料與儀器

1.1 藥品 新磺棕小兒止咳合劑（規格：60ml/瓶，批號：20090102，20090106，20090109），由海南省人民醫院制劑中心配制。

1.2 培養基、菌種及來源 培養基：營養瓊脂，批號：0611287；玫瑰紅鈉瓊脂，批號：0705116；膽鹽乳糖培養基，批號：0701100，由北京三藥科技開發公司提供；MUG培養基，批號：0701036，由北京牛牛基因技術有限公司提供。陽性對照菌：大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌（Staphy-lococcus aureus）［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉CMCC（F）98003，由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 儀器 DSX—3型高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；PYX—250S—A型生化培養箱（廣東韶關科力實驗儀器有限公司）；凈化工作臺（上海匯龍儀表電子有限公司）；PYX—250M—A霉菌培養箱（廣東韶關科力實驗儀器有限公司）；HTY反復使用過濾器（杭州高得醫療器械有限公司）。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

2.1.1 取經37℃培養 18-24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的肉湯培養物各1ml，加9ml滅菌生理鹽水，10倍稀釋至10-6，細菌數約為50-100cfu，做活菌計數備用。

2.1.2 取經25℃培養 18-24h的白色念珠菌培養物1ml，加9ml滅菌生理鹽水，10倍稀釋至10-5，細菌數約為50-100cfu，做活菌計數備用。

2.1.3 取經25℃培養 1周的黑曲霉斜面培養物加3-5ml滅菌生理鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液1ml，加入滅菌生理鹽水9ml，10倍稀釋至10-4，菌數約為50-100cfu，做活菌計數備用。

2.1.4 供試品溶液的制備 本品放置5min后取上清液10ml，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨稀釋液至100ml，作為1∶10的供試液。

2.2 抑菌性試驗［2］用需氧菌、厭氧菌培養基6管及真菌培養基4管分別接種規定量（50-100cfu）的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各兩管，均在規定的溫度下培養7d。結果見表1。

表1 抑菌性試驗結果Table 1 The results of antibacterial test

從表1結果可知，含供試品的培養管與未加供試品的培養管比較，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌不生長；白色念珠菌、黑曲霉菌能生長。說明該供試品對細菌有很強的抑菌作用，但對霉菌、酵母菌無抑菌作用。

2.3 細菌數檢查方法的研究

2.3.1 試驗組 取1∶10的供試液1ml，薄膜過濾，以0.1％蛋白胨水溶液為沖洗液沖洗，每次100ml，共制備3組，每組在最后一次沖洗液中加入1％對氨基苯甲酸溶液10ml，反應30min，然后分別加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌液各1ml，過濾后取出濾膜，分別貼于營養平皿中于30-35℃培養。結果見表2。

2.3.2 菌液組 取試驗菌1ml，采用平皿法，每種試驗菌均做兩份平行試驗。

2.3.3 供試品對照組 不加菌液，其他操作同試驗組，測量樣品本底菌數。

2.3.4 稀釋劑對照組 取0.1％蛋白胨水溶液1ml，薄膜過濾，同上操作。

表2 薄膜法測定3種陽性菌回收率試驗結果Tahle 2 The recovery test results using Filtration m emb ranem ethod

從表2結果可知，取1：10供試液1ml按照中和法和薄膜過濾法處理，當沖洗量為500ml并加1％對氨基苯甲酸溶液10ml時，結果人工污染大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌試驗組的菌回收率均大于70％，符合中國藥典2005年版驗證的要求。

2.4 霉菌和酵母菌檢查的研究

2.4.1 試驗組 按照平皿法，取兩組平皿，每組2個，分別加入1∶10供試液1ml，然后每組分別加入白色念珠菌和黑曲霉菌各1ml，傾注20ml玫瑰紅鈉瓊脂培養基，靜置放冷后于23-28℃培養72h。結果見表3。

2.4.2 菌液組 取試驗菌1ml，采用平皿法，每種試驗菌均做兩份平行試驗。

2.4.3 供試品對照組 不加菌液，其他操作同試驗組，測量樣品本底菌數。

表3 霉菌和酵母菌回收率試驗結果Table 3 The recovery test results of molds and saccharomycetes

從表3結果可知，取1：10供試液1ml按照平皿法進行處理，結果人工污染白色念珠菌和黑曲霉菌試驗組的菌回收率均大于70％，符合中國藥典2005年版驗證的要求。

2.5 大腸埃希菌檢查

2.5.1 取1∶10供試液1ml薄膜過濾，以0.1％的蛋白胨水溶液為沖洗液沖洗，每次100ml，最后一次沖洗液中加入1％對氨基苯甲酸溶液10ml，反應30min，濾膜取出放入100ml膽鹽乳糖培養基中，制備兩組，其中一組加入大腸埃希菌1ml，作為試驗組，另一組加入金黃色葡萄球菌液1ml，作為陰性對照組，兩組均置（36±1）℃溫度培養24h。

2.5.2 取上述培養物各0.2ml接種至5ml-MUG培養基試管內，（36±1）℃培養，于5h、24h在365nm的紫外燈下觀察，同時用未接種的MUG培養基做本底對照。結果見表4。

表4 大腸埃希菌檢查方法驗證結果Table 4 Recovery rate of Escherichia coliin the validation test

從表4結果可知，采用中和法和薄膜過濾法處理，沖洗量為500ml，并在最后一次沖洗液中加入1％對氨苯甲酸溶液10ml，反應30min，試驗組檢出試驗菌，陰性對照組未檢出陰性對照菌，可滿足中國藥典2005年版驗證要求。

3 結論

根據上述結果，新磺棕小兒止咳合劑微生物限度檢查中的細菌數檢查和控制細菌檢查可依據中國藥典微生物限度檢查方法中的中和法和薄膜過濾法處理，沖洗量至少為500ml，并在最后一次沖洗液中加入1％對氨苯甲酸溶液10ml，反應30min。霉菌和酵母菌數檢查可依據中國藥典微生物限度檢查方法中的平皿法進行。

4 討論

4.1 具有抑菌藥物的微生物限度檢查結果的準確性，主要取決于供試品本身在試驗條件下是否抑制被檢微生物的生長繁殖［3］。檢驗時應排除其抑菌作用，使之不干擾染菌的限度檢驗。《中國藥典》規定細菌、霉菌和酵母菌計數方法驗證的菌回收率應不低于70％。從上述結果可以看出，供試品對細菌生長有較強的抑制作用，采用中和法和薄膜過濾法進行陽性對照菌回收試驗，菌回收率均大于70％，檢測結果符合要求。

4.2 菌懸液配制過程中，每一級稀釋液都應充分振搖混勻，由于菌種為特殊活性的生物，許多因素都會影響到最終菌懸液配制濃度。因此，試驗時應確定相關參數（接種量、培養溫度、培養時間、培養基的量）以便于更快找到所要的稀釋級。制備好的原菌懸液以當天使用為宜，超過1周應重新計數［4］。另外，菌懸液配置過程中試驗者應注意自我保護，防止感染。

［1］國家藥典委員會.中國藥典2005年版二部附錄［S］.北京：化學工業出版社，2005∶93.

［2］盧文斌.冰硼散微生物限度檢查方法學驗證［J］.中國藥房，2007，18（18）∶1 396-1 397.

［3］向 東，范 兵，李紅纓.薄膜過濾法檢查蜂膠牙泰噴霧劑中微生物的限度［J］.華西藥學雜志，2006，21（3）∶299-300.

［4］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊［M］.北京：科學出版社，2000∶62.