阿霉素誘導食管癌耐藥細胞中ABCG2的表達及其意義

劉亮，左靜，趙麗，王靜，郭建文，劉江惠，左連富

（河北醫科大學 第四醫院1.腫瘤研究所流式細胞室；2.腫瘤內科，石家莊050011）

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，目前食管癌化療過程中出現的耐藥現象嚴重影響了治療效果。因此，闡明食管癌化療的耐藥現象就十分重要。ATP結合轉運蛋白G超家族員2（ATP-binding cassetee transporter G2，ABCG2）是新發現的與化療耐藥有關的因子。研究發現，ABCG2在多種腫瘤中高表達［1～3］，并且我們研究發現，ABCG2在食管癌中也有高表達［4］，認為ABCG2參與了食管癌耐藥的形成。本實驗采用遞增阿霉素（adriamycin，ADM）的濃度，來誘導食管癌細胞（Eca109）細胞產生耐藥，建立耐藥食管癌細胞模型，并利用多項實驗方法檢測其生物學特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器：ADM，浙江海正藥業股份有限公司；引物，上海生工生物公司；反轉錄試劑盒，Promega公司；Trizol試劑，Gibco BRL公司；流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司；PCR擴增儀，德國eppendorf公司；ABCG2抗體，Biolegend公司（用于流式細胞術檢測）；ABCG2抗體（克隆號：sc-18841）購自SANTA CRUZ公司（用于Western Blot方法檢測）。

1.1.2 細胞株：人食管癌Eca109細胞株由本實驗室傳代培養，接種細胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中（補充青霉素、鏈霉素各100 U/L），培養器皿置于37℃含有5%CO2的細胞培養箱中。

1.2 方法

1.2.1 耐藥細胞株Eca109/ADM的誘導：采用藥物持續接觸濃度遞增誘導法［5］，將對數生長期Eca109細胞接種于含低濃度ADM（0.002 μg/ml）的培養基中，根據細胞的生長情況不斷提高藥物濃度，直到細胞能在含ADM濃度為0.02 μg/ml的培養基中穩定生長，歷時8個月。細胞命名為Eca109/ADM細胞。

1.2.2 藥敏試驗：采用MTT法檢測Eca109細胞、Eca109/ADM細胞對ADM的敏感性。Eca109/ADM細胞在不含ADM的RPMI1640培養基中培養2周后備用，取對數生長期的Eca109細胞、Eca109/ADM細胞，用RPMI1640培養基制備成單細胞懸液，分別接種到 96 孔板（200 μl/孔，約1×105個/孔），培養4 h細胞貼壁后，參照ADM對人的藥物血漿高峰濃度加入不同濃度的ADM（設3個復孔），再培養24 h后，每孔加入20 μl（5 mg/ml）MTT繼續培養4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜150 μl/孔，充分振蕩10 min，酶標儀測每孔A490 nm值。計算細胞存活率（存活率=實驗組A490 nm值/對照組A490 nm值×100%），應用統計學軟件SPSS11.5計算半數抑制濃度（IC50），從而計算耐藥指數（RI）=耐藥細胞 IC50/親本細胞IC50。

1.2.3 RT-PCR方法檢測細胞中ABCG2mRNA的表達：取生長狀態良好處于對數生長期的Eca109、Eca109/ADM細胞，冷PBS洗滌2次，加入1 ml Trizol試劑，常規一步法提取總RNA。RT-PCR方法采用兩步法［6］，ABCG2 上游引物5′-GGTCAGAGTGTGGTTTCTGTAGCA-3′，下游引物5′-GTGAGAGATCGATGCCCTGCTTTA-3′。 擴增片段280 bp。GAPDH 上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTG-3′，擴增片段452 bp。擴增條件為94℃5 min，94℃30 s，63.1℃30 s，72 ℃30 s，共30 個循環，72 ℃10 min。對擴增產物進行1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，在凝膠成像分析儀下成像，用Gel-proAnalyzer3.1軟件分析擴增產物的光密度（optical density，OD）值，計算ABCG2OD值/GAPDHOD值的比值，對ABCG2 mRNA表達強度進行光密度半定量分析。

1.2.4 流式細胞術方法檢測細胞中ABCG2蛋白的表達：取生長狀態良好，處于對數生長期的Eca109、Eca109/ADM細胞，冷PBS洗滌2次，用0.25%胰酶消化，4℃預冷的PBS緩沖液洗2次細胞后，離心棄去上清液，冷PBS液將沉淀細胞重懸成1×106/100 μl，向細胞懸液中加入FITC標記的ABCG2抗體，避光作用2 h后，流式細胞儀檢測細胞中ABCG2蛋白的表達量，以平均熒光強度表示蛋白的含量。實驗重復3次。

1.2.5 Western Blot方法檢測細胞中ABCG2蛋白的表達：取生長狀態良好，處于對數生長期的Eca109、Eca109/ADM細胞，冷PBS洗滌2次，使用RIPA試劑常規方法提取細胞蛋白。常規Western Blot方法檢測細胞中ABCG2蛋白，其中β-actin為內參照。對條帶進行掃描，并用Gel-Pro Analyzer3.1軟件分析條帶的光密度值，計算ABCG2條帶OD/β-actin條帶OD值，作為ABCG2的相對含量。實驗重復3次。

1.2.6 藥物外排實驗：取對數生長期的Eca109、E－ca109/ADM細胞4×105個/孔接種于6孔板中，在37℃、5%CO2的培養箱中培養，待細胞貼壁后加0.02 μg/mlADM作用2 h后，棄去上清液，換無ADM藥物的含10%胎牛血清RPMI1640培養基，在37℃、5%CO2的培養箱中繼續培養1 h。棄去上清，冷PBS液洗滌細胞兩遍。收集細胞，流式細胞儀上檢測細胞內ADM的熒光強度。細胞內的ADM受488 nm的激光激發后能產生紅色熒光，可被流式儀接收，測出熒光強度，從而反映細胞內ADM的含量。每組設6復孔。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 耐藥細胞株Eca109/ADM細胞培養

歷時8個月，成功培養了耐藥細胞株Eca109/ADM。與Eca109細胞相比，Eca109/ADM細胞體積變大，形態更不規則。見圖1。

2.2 藥敏實驗

MTT方法檢測，ADM藥物作用Eca109/ADM細胞、Eca109細胞24 h，采用統計學軟件SPSS11.5計算 IC50值，分別為15.45±1.15，4.69±0.88，耐藥系數為3.29倍。

2.3 RT-PCR方法檢測細胞中ABCG2mRNA的表達

Eca109、Eca109/ADM細胞中ABCG2mRNA的表達量分別為0.67±0.04、0.82±0.10，Eca109/ADM 細胞中ABCG2mRNA的表達顯著增高（P<0.05）。

2.4 流式細胞術檢測細胞中ABCG2蛋白的表達

Eca109/ADM細胞、Eca109細胞中ABCG2蛋白表達量分別為 659.88±10.60、628.25±12.49，Eca109/ADM細胞中ABCG2蛋白的表達量較Eca109細胞顯著性增高（P<0.01）。

2.5 Western Blot方法檢測細胞中ABCG2蛋白的表達

Eca109/ADM細胞中ABCG2蛋白的表達量較Eca109細胞增高，見圖2。

2.6 藥物外排實驗

Eca109/ADM細胞內ADM的含量與Eca109細胞內ADM的含量相比降低，Eca109/ADM細胞外排ADM的作用較Eca109細胞增加。見圖3。

3 討論

抗腫瘤藥物產生耐藥是導致腫瘤化療達不到預期效果甚至失敗的主要原因之一。ADM是蒽環類細胞毒抗生素，是一種廣譜抗腫瘤藥物，對多種腫瘤的治療有較好的療效，由于它的抗腫瘤活性強，所以在臨床化療中被廣泛應用，占有重要地位。但是ADM具有很大的毒副作用和易產生耐藥性的特點，嚴重影響了其在臨床上的作用。要提高其臨床療效，需逆轉腫瘤對其耐藥。ABCG2是近來發現的與多藥耐藥相關的半轉運蛋白，屬ABC轉運蛋白超家族成員之一［7～10］，具有將化療藥物米托蒽醌、ADM等從腫瘤細胞泵出的作用，使腫瘤細胞產生耐藥。

本研究采用藥物濃度遞增法，體外誘導耐藥腫瘤細胞系Eca109/ADM，建立食管癌耐藥細胞模型，研究ABCG2與食管癌耐藥的關系。實驗從ADM0.002 μg/ml濃度開始逐漸增加藥物的濃度，最終使細胞在0.02 μg/ml ADM中穩定生長。藥物濃度增長10倍，在此過程中細胞形態發生變化，細胞體積變大，形態變得更不規則。應用MTT方法檢測到E－ca109/ADM細胞對ADM產生了耐藥，耐藥系數為3.29。接下來研究Eca109/ADM細胞的耐藥機制，應用了多項實驗技術檢測Eca109/ADM細胞耐藥因子的表達，發現ABCG2mRNA及蛋白在Eca109/ADM細胞中高表達，提示ABCG2參與了Eca109/ADM細胞耐藥形成。同時我們還利用流式細胞技術檢測了Eca109/ADM細胞外排藥物作用，發現Eca109/ADM細胞外排ADM作用增加，提示Eca109/ADM細胞中高表達的ABCG2可以外排ADM，從而使Eca109/ADM細胞產生耐藥。

綜上研究，本實驗所誘導的耐藥細胞株Eca109/ADM是一個典型的具有ABCG2表型的耐藥模型，并且高表達ABCG2。提示ABCG2有望成為食管癌耐藥逆轉治療的新靶點。

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