絲膠預(yù)處理對DN大鼠腎臟細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

陳志宏，宋成軍，付秀美，付文亮，薛景鳳

（承德醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖學(xué)教研室，河北 承德06 7000）

近年來糖尿病的發(fā)病率逐年上升，其中糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是導(dǎo)致慢性腎功能不全和終末期腎功能衰竭的主要原因［1，2］。DN的典型病理改變?yōu)槟I小球毛細(xì)血管基底膜增厚、系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)增多，導(dǎo)致結(jié)節(jié)性或彌漫性腎小球硬化，這些改變的組織學(xué)基礎(chǔ)是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的進(jìn)行性積聚。ECM積聚由ECM合成和降解兩個方面決定，正常生理狀態(tài)下，ECM產(chǎn)生和降解的動態(tài)平衡受到精細(xì)調(diào)控，糖尿病時由于糖代謝異常和多種細(xì)胞因子的參與，導(dǎo)致ECM產(chǎn)生增多、降解減少，引起ECM積聚［3］。本文采用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）致DN大鼠模型，觀察彩色蠶繭提取物——絲膠預(yù)處理對DN大鼠腎臟ECM相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為DN的防治提供理論依據(jù)和實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物分組及處理

清潔級雄性SD大鼠36只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，合格證號：712024。將大鼠隨機(jī)分為3組：正常對照組、DN模型組和絲膠預(yù)防組，每組12只。模型組和絲膠預(yù)防組大鼠均采用2%STZ（25 mg/kg，3 d）連續(xù)腹腔注射建立動物模型，以血糖≥16.7 mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)；絲膠預(yù)防組大鼠于注射 STZ 前給與絲膠（2.4 g·kg-1·d-1）灌胃35 d。

1.2 藥物與試劑

絲膠由彩色蠶繭（承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供）經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成。STZ購于美國Sigma公司，臨用時用pH 4.4的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液配成2%的溶液；血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司；兔抗轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抗體、兔抗 Smad3 抗體、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitors of maprix metalloproteinases-1，TIMP-1） 抗體，美國Santa公司（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Ⅳ型膠原 （typeⅣ collagen，cⅣ） 和層黏蛋白（laminin，LN）酶免疫試劑盒，上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，北京泰格美科技有限公司。

1.3 檢測血液指標(biāo)

各組大鼠禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，3000 r/min離心20 min，收集血清。應(yīng)用日本日立公司的Boehr inger Mannhe in/Hitachi 717全自動臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖，ELISA法檢測cⅣ和LN。

1.4 測定腎質(zhì)量/體質(zhì)量

各組大鼠取血前稱體質(zhì)量，取血后斷頭處死，取雙側(cè)腎去掉包膜后稱質(zhì)量，計算腎質(zhì)量/體質(zhì)量。然后，一側(cè)腎臟投入液氮中速凍，后移入-80℃冰箱保存，用于Western blot檢測；另一側(cè)腎臟入Bounin液固定，用于免疫組化染色。

1.5 腎臟相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測

1.5.1 免疫組化染色及定量分析：入Bounin液固定腎臟，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm。采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測腎臟TGF-β1和TIMP-1蛋白的表達(dá)。一抗為兔抗，稀釋濃度為1∶100，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以PBS代替一抗作為陰性對照，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對免疫組化陽性結(jié)果進(jìn)行定量分析：切片在×400顯微鏡下選取腎小球，計算陽性產(chǎn)物面積占腎小球面積的百分比。每只動物任選3張切片，每張切片選取3個腎小球，取平均值。

1.5.2 腎臟Smad3蛋白表達(dá)的檢測：取200 mg腎臟組織，提取蛋白，以BCA蛋白試劑盒定量蛋白濃度。采用Western blot方法檢測大鼠腎臟Smad3蛋白的表達(dá)，蛋白上樣量為60 μg。12%SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜；一抗稀釋濃度為1∶200，4℃過夜；Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。采用Quantiy One軟件對顯影條帶進(jìn)行分析，以Smad3條帶與βactin條帶的灰度比值作為Smad3蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的腎質(zhì)量/體質(zhì)量

與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠的腎質(zhì)量/體質(zhì)量明顯升高（P＜0.01）；絲膠預(yù)防組大鼠的腎質(zhì)量/體質(zhì)量明顯低于模型組（P＜0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠血液指標(biāo)檢測結(jié)果

與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠的血糖、cⅣ和LN均明顯升高（P＜0.01）；絲膠預(yù)防組大鼠的血糖、cⅣ和LN明顯低于模型組（P＜0.01）。見表1。

2.3 各組大鼠腎臟Smad3蛋白的表達(dá)

在蛋白Marker的55 kDa水平處，可見Smad3蛋白條帶；在蛋白Marker的43 kDa水平處，可見βactin條帶（圖1）。模型大鼠腎臟Smad3蛋白的表達(dá)明顯高于正常對照組大鼠（P＜0.01），絲膠預(yù)防組大鼠腎臟Smad3蛋白的表達(dá)明顯低于模型組大鼠（P＜0.01）。見表2。

2.4 各組大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達(dá)

TGF-β1免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)膩顆粒狀，位于細(xì)胞質(zhì)；TGF-β1免疫陽性細(xì)胞包括腎小球囊壁層上皮細(xì)胞、足細(xì)胞和球內(nèi)系膜細(xì)胞。與正常對照組大鼠相比，模型大鼠腎臟（圖2）TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯增高（P＜0.01）；絲膠預(yù)防組（圖3）大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯低于模型大鼠（P＜0.01），見表2。

2.5 各組大鼠腎臟TIMP-1蛋白的表達(dá)

TIMP-1免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)膩顆粒狀，位于細(xì)胞質(zhì)，免疫陽性細(xì)胞為腎小球球內(nèi)系膜細(xì)胞。與正常對照組大鼠相比，模型大鼠（圖4）腎臟TIMP-1蛋白的表達(dá)明顯增高（P＜0.01）；絲膠預(yù)防組（圖5）大鼠腎臟TIMP-1蛋白的表達(dá)明顯低于模型大鼠（P＜0.01）。見表2。

3 討論

ECM家族有四大成員：膠原蛋白、彈性蛋白質(zhì)、蛋白多糖和結(jié)構(gòu)糖蛋白。他們不僅是細(xì)胞外的惰性充填物，還具有活躍的生物活性，參與細(xì)胞的運(yùn)動、增殖、分化等，并可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與生物分子之間的相互作用，在胚胎發(fā)育和各種生理及病理過程中發(fā)揮重要作用［4］。機(jī)體內(nèi)有多種細(xì)胞因子和酶參與ECM的合成與降解，從而維持正常生理條件下ECM的動態(tài)平衡，TGF-β1/Smad3信號通路和MMPs/TIMPs就是其中的重要成員。

TGF-β的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有Ⅰ型和Ⅱ型受體（TGF-βRⅠ和 TGF-βRⅡ）參與；Smad家族蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的參與TGF-β家族在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)，在將TGF-β信號從細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起關(guān)鍵作用［5］。TGF-β可通過與自身受體結(jié)合，進(jìn)而磷酸化Smad蛋白并與之形成復(fù)合物，激活合成ECM等成分的活性［6］。研究證明，糖尿病大鼠腎臟中TGF-β1/Smda3信號通路處于激活狀態(tài)，激活的TGF-β1/Smad3信號通路可增加ECM各成分的表達(dá)，加速ECM進(jìn)行性積聚，從而導(dǎo)致腎小球硬化，最終導(dǎo)致終末期腎病的發(fā)生［7］。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix matalloproteinases，MMPs）幾乎可以降解除多糖以外的全部ECM成分，其表達(dá)下調(diào)或者酶活性過度受抑，可引起ECM積聚，導(dǎo)致腎小球硬化［4］。TIMPs是腎內(nèi)調(diào)節(jié)MMPs活性的主要物質(zhì)，它可與MMPs形成MMP-TIMP復(fù)合體，阻斷MMPs與底物的結(jié)合和活化，參與調(diào)節(jié)ECM的代謝過程。在腎臟對MMPs發(fā)揮抑制作用的主要是TIMP-1。DN時，腎臟Ⅳ型膠原和TIMP-1 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，通過直接抑制ECM降解和降低MMPs的活性，引起ECM降解減少、積聚增加，久之發(fā)生腎小球硬化和腎功能衰竭［8，9］。

蠶絲是人類最早利用的天然蛋白質(zhì)之一，主要由兩條絲素和周轉(zhuǎn)覆蓋的絲膠兩部分組成。以往的研究主要集中在絲素方面，約占繭絲30%的絲膠作為廢料丟棄，浪費(fèi)了大量的生物資源。絲膠的主要成分絲膠蛋白（通稱絲膠）為高分子水溶性蛋白，由18種氨基酸組成。目前對絲膠的研究主要集中在美容、護(hù)膚、營養(yǎng)與保健等方面；在治療糖尿病方面的作用，僅有國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)絲膠可有效降低血糖［10，11］。本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠預(yù)防組大鼠血清ECM成分cⅣ和LN的含量、腎臟Smad3、TGF-β1和TIMP-1蛋白的表達(dá)明顯低于DN大鼠（P＜0.01）。這表明，絲膠預(yù)處理可抑制DN腎臟中TGF-β1/Smad3信號通路的激活，防止TIMP-1蛋白高表達(dá)導(dǎo)致的MMPs活性的降低，從而預(yù)防DN時ECM的積聚和腎小球硬化，對DN的發(fā)生發(fā)展具有良好的預(yù)防作用。由于絲膠是天然的蛋白質(zhì)，具有生物相容性，可生物降解，對人體無毒性，避免了化學(xué)合成藥物帶給人體的不良反應(yīng)，因此具有良好的應(yīng)用推廣前景。

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