Twist蛋白在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

舒紅，張洪蘭，趙曉東，姜衛國

（中國醫科大學 附屬盛京醫院病理科，沈陽110004）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發生、發展和侵襲擴散機制目前尚不清楚。扭曲基因（twistgene）是一種堿性螺旋-環-螺旋（basichelix loop helix，bHLH）轉錄因子，主要表達于鼠及人類等的胎盤、胚胎中胚層和成人的某些中胚層來源的未分化組織。它作為抑制凋亡及上皮-間質轉變的重要調控因子在多數腫瘤中的表達已得到了證實。本研究通過檢測扭曲蛋白（Twist protein）蛋白在NSCLC組織中的表達，探討twist基因在NSCLC臨床、病理診斷中的作用及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇中國醫科大學附屬盛京醫院病理科存檔的NSCLC石蠟標本61例作為實驗組，其中男45例，女16例。另取癌旁正常肺組織15例作為對照組。根據2004年WHO肺癌分類標準進行組織學分類：腺癌22例，鱗癌36例，腺鱗癌3例；高分化31例，中分化26例，低分化4例。按國際抗癌聯盟2009年的TNM分期進行分期：Ⅰ、Ⅱ期共45例，Ⅲ、Ⅳ期共16例。有淋巴結轉移25例，發生遠處轉移3例。所有病例均有完整的隨訪資料。

1.2 試劑

Twist鼠抗人單克隆抗體（H-81，SC15393）購自Santa Cruz公司，免疫組化染色試劑（SP9002）、DAB顯色液（ZLI-9033）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 檢測方法

采用S-P免疫組化法。石蠟切片常規脫蠟，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性，pH9.0的EDTA緩沖液中經高壓鍋抗原修復，加入10%的胎牛血清37℃孵育，加Twist單克隆抗體（1∶200稀釋）4℃過夜。加生物素標記二抗37℃孵育，加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37℃孵育，DAB染色，蘇木素復染。用PBS代替一抗做空白對照。

1.4 結果判斷標準

Twist蛋白表達于細胞質和細胞膜。按染色強度計分：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；在高倍鏡（×40）下取5個不同視野，各計數200個細胞，按陽性細胞所占的百分比計分：陰性為0分，陽性細胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，﹥75%為4分。染色強度與陽性細胞百分比的積分乘積≥3分為免疫反應陽性，否則為陰性。

1.5 統計學分析

計數資料采用率表示，不同組間比較用χ2檢驗及Fisher確切概率法；生存率的比較采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗，預后因素分析采用Cox分析。用SPSS14.0統計軟件進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Twist蛋白的表達

Twist在NSCLC中的陽性表達率為72.1%（44/61），明顯高于對照組的 6.7%（1/15）（P ＜0.05）。

2.2 NSCLC組織中Twist蛋白表達與臨床病理學特征的關系

NSCLC中Twist蛋白表達與組織學類型、臨床分期及淋巴結轉移有關（P＜0.05），而與年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤分化程度、腫瘤大小及遠處轉移無關（P＞0.05）。見表1。

2.3 NSCLC組織中Twist表達與患者術后生存期的關系

對61例患者進行Kaplan-Meier生存分析，結果顯示，Twist蛋白表達陰性組患者平均生存期為69.4個月，Twist蛋白表達陽性組患者平均生存期為46.8個月。雖然Twist蛋白陰性組患者生存期高于陽性組，但其差異無顯著的統計學意義（圖1），Log-rank檢驗 P＞0.05。

對隨訪超過4年的48例患者進行Twist蛋白差異性表達的研究發現，Twist蛋白在術后生存時間＜4年的患者中表達較高（P＜0.05）。見表2。

2.3 NSCLC患者術后死亡的Cox分析

患者年齡可直接納入模型，以下9個變量首先進行賦值：性別（男=0，女=1），吸煙狀況（無=0，有=1），腫瘤大小（T1=0，T2=1，T3=2，T4=3），淋巴結轉移（無=0，有=1），遠處轉移（無=0，有=1），臨床分期（Ⅰ=0，Ⅱ=1，Ⅲ=2，Ⅳ=3），分化程度（高分化=0，中分化=1，低分化=2），Twist蛋白表達（“-”為0，“+”為1）。賦值后分別進行Cox分析，結果顯示對患者術后死亡有顯著影響的因子為吸煙及淋巴結轉移（P＜0.05），且均為危險因子，而性別、年齡、腫瘤大小、病理分級、臨床分期、Twist蛋白的表達對NSCLC患者的死亡無明顯影響。見表3。

3 討論

twist基因是一種高度保守的堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子，在胚胎的中胚層形成，特別是在肌形成中起關鍵作用［1］。目前已在多種人類上皮來源腫瘤中，如乳腺癌［2，3］、卵巢癌［4］、肝細胞癌［5］、鼻咽癌［6］、前列腺癌［7，8］等，發現 Twist表達增高，并與患者預后關系密切，而在非小細胞肺癌中的研究目前還較少。Twsit促進腫瘤細胞侵襲轉移的主要機制在于它可抑制 E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的轉錄表達［9］，致使腫瘤細胞容易脫離原發病灶而易于向周圍組織侵襲，并為腫瘤的遠處轉移提供了必要條件。另外，Twist能識別并結合靶基因啟動子上E-box基序的DNA結合序列誘導上皮-間質轉變［10］。

本研究通過對NSCLC及癌旁正常肺組織中Twist蛋白的表達進行檢測分析，證實Twist蛋白在肺癌中表達陽性率顯著高于對照組（P＜0.05），與Song在鼻咽癌中的研究結果相同［6］。Twist蛋白陽性表達與NSCLC的臨床分期、淋巴結轉移呈顯著正相關（P＜0.05）。同時，Twist蛋白在鱗癌中的表達明顯高于腺癌的表達，可能與鱗癌具有更強的侵襲和轉移能力有關，這有待進一步探討。結果還顯示了發生遠處轉移的NSCLC中Twist蛋白的表達率達100%（3/3），而Fisher確切概率法得到的P值卻是大于0.05，這可能與標本構成中遠處轉移的樣本數量太少有關。

由于Twist對腫瘤發生和遠處轉移具有促進作用，因而可能對患者預后產生不良影響。本研究中Kaplan-Meier生存曲線證實了Twist蛋白陽性表達患者術后生存率較低，但Log-rank檢驗P＞0.05，可能與樣本量較小有關，相信大樣本研究可得到有統計學意義的結果。

同時，我們對隨訪時間≥4年的48例患者進行了Twist蛋白表達結果的比較，發現生存時間≥4年的患者的Twist蛋白陽性表達率明顯低于生存期＜4年的患者，Twist蛋白陽性表達與患者長期生存的預后顯著相關。

Cox分析表明，吸煙及淋巴結轉移是影響NSCLC患者預后的獨立危險因子。大多數腫瘤的預后都是多因素作用的結果，而吸煙可以作為NSCLC的預后獨立因素，再一次驗證了吸煙的危害性。同時，淋巴結轉移也是影響預后的一個獨立因素，提示在手術過程中必須認真清除各組淋巴結。

本研究結果提示，twist基因很可能是NSCLC發生發展中一個新的重要基因，也是與患者長期預后有關的一個重要因素。twist基因所參與的信號通路及與其他信號通路的對話仍有待進一步研究。

［1］Baylies MK，Bate M.Twist：a myogenic switch in Drosophila［J］.Science，1996，272（5267）：1481-1484.

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［4］Kajiyama H，Hosono S，Terauchi M，et al.Twist expression predicts poor clinical outcome of patients with clear cell carcinoma of the ovary［J］.Oncology，2006，71（5/6）：394-401.

［5］Lee TK，Poon RT，Yuen AP，et al.Twist overexpression correlates withhepatocellularcarcinomametastasisthroughinductionofepithelial-mesenchymal transition ［J］.Clin Cancer Res，2006，12（18）：5369-5376.

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［8］Yuen HF，Kwok WK，Chan KK，et al.TWIST modulates prostate cancer cell-mediate bone cell activity and is upregulated by osteogenic induction［J］.Carcinogenesis，2008，29（8）：1509-1518.

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［10］Zhao J，Wang P，Corsi AK.The C.elegans Twist target gene，arg-1，is regulated by distinct E box promoter elements［J］.Mech Dev，2007，124（5）：377-389.