阿司匹林對人子宮內膜腺癌Ishikawa細胞生長和凋亡的影響

趙冬妮，金英楠，李艷霞，馬曉欣

（1.中國醫(yī)科大學 附屬盛京醫(yī)院婦產科，沈陽110004；2.北京市西城區(qū)疾病預防控制中心 生殖保健科，北京100029）

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多基因及其他多種因素的共同參與，是細胞增殖與凋亡機制紊亂的結果。抑制腫瘤細胞增殖，誘導其發(fā)生凋亡在腫瘤的預防和治療過程中發(fā)揮著重要的作用。目前，越來越多的研究表明，非甾體類抗炎藥物阿司匹林能夠通過抑制細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡而降低胃癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生，對腫瘤具有一定的預防和治療作用［1，2］。本研究探討了阿司匹林對人子宮內膜腺癌Ishikawa細胞增殖的影響，同時檢測其對細胞周期分布和細胞凋亡情況的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人子宮內膜腺癌Ishikawa細胞株由北京大學病理生理教研室提供。阿司匹林購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Santa Cruz公司；胎牛血清購自德國Chrome公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國Amresco公司；RNaseA購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將Ishikawa細胞株置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中貼壁傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT比色實驗檢測細胞增殖抑制率：取對數(shù)生長期的Ishikawa細胞，以每孔5×103個接種于96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后進行實驗。實驗組中分別加入含50，25，12.5，6.25，3.125，1.563 mmol/L阿司匹林的培養(yǎng)基，陰性對照組細胞加入無藥物的培養(yǎng)基，空白對照組中無細胞只加無藥物的培養(yǎng)基。將按上述方法給藥的培養(yǎng)板分別培養(yǎng)24，48，72 h 后，吸去上清液，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，加入200 μl DMSO，振蕩10 min，用酶標儀測定各孔吸光度（A）值。細胞抑制率=（陰性對照組平均A值-實驗組平均A值）/（陰性對照組平均A值-空白組平均A值）×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率的變化：取對數(shù)生長期的Ishikawa細胞，實驗組分別加入含終濃度為1，3，10 mmol/L阿司匹林的DMEM培養(yǎng)基，對照組加入不含阿司匹林的等量DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。收集細胞，以70%乙醇固定，加入100 μl RNaseA（1 mg/ml），置于37 ℃水浴30 min 后以 400 μl碘化丙錠（50 μg/ml）染色，置暗處10 min后上流式細胞儀檢測細胞周期比例及細胞凋亡率。

1.2.4 透射電鏡觀察細胞凋亡的形態(tài)變化：收取按上述方法（1.2.3）培養(yǎng)后的細胞，加入1 ml戊二醛（2.5%）固定，制成超薄切片，于透射電子顯微鏡下觀察細胞超微結構的變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 阿司匹林作用后Ishikawa細胞增殖的抑制率

MTT比色法檢測顯示，阿司匹林濃度為1.56 mmol/L，作用時間為24 h時，細胞增殖受到輕度抑制（15.99%），隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細胞增殖的抑制作用逐漸增強，各濃度及時間點間比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），阿司匹林對Ishikawa細胞增殖的抑制作用呈劑量與時間依賴關系（表1）。半數(shù)抑制濃度（IC50）為 4.7 mmol/L，因此，以下實驗選擇濃度為1 mmol/L，3 mmol/L，10 mmol/L。

2.2 阿司匹林對Ishikawa細胞周期分布及凋亡率的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，隨著藥物濃度的增加，G1期細胞分布明顯增加，細胞凋亡率增加，對照組及各濃度實驗組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2）。

2.3 阿司匹林作用后Ishikawa細胞的形態(tài)變化

透射電鏡結果顯示，對照組細胞呈圓形，體積較大，形態(tài)飽滿，核內常染色質分布較均勻，細胞表面可見絨毛（圖1A）；阿司匹林藥物作用后，細胞皺縮明顯，染色質于核膜周圍邊集、固縮，形成新月體或花瓣形，電子密度增強，可見凋亡小體形成（圖1B）。

3 討論

1982 年，Doubilet［3］首次報道了長期服用阿司匹林的人群較普通人群結直腸癌的發(fā)病率明顯降低，此后數(shù)項流行病學調查、動物實驗和體外實驗都得出了類似的結論。Castano等［4］應用阿司匹林作用于HT229結腸腺癌細胞株，發(fā)現(xiàn)HT229細胞的存活率與阿司匹林的劑量和處理時間相關；Moysich等［5］通過臨床調查發(fā)現(xiàn)，規(guī)律服用阿司匹林可有效降低肥胖婦女子宮內膜癌的發(fā)病率；Hector等［6］研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林能夠以劑量依賴的方式抑制體外Ishikawa子宮內膜腺癌細胞株的生長，細胞凋亡是這些變化的機制之一；Shiff等［7］研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可改變結腸癌細胞形態(tài)，使細胞聚集在G0/G1期，在一定濃度下誘導凋亡。

近年來，在非甾體類抗炎藥物臨床應用與研究的過程中，人們發(fā)現(xiàn)阿司匹林等具有防治腫瘤的作用。其誘導腫瘤細胞凋亡的相關機制主要分為依賴于環(huán)氧化酶-2（cyclo-oxygenase，COX-2）途徑和非COX-2途徑兩大方面。研究認為，COX-2的活性增高可以引起前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）和Bcl-2的高度表達，降低E-鈣黏蛋白的活性而抑制細胞凋亡、刺激血管生成，從而導致腫瘤的發(fā)生，并增加惡性腫瘤的侵襲力。而阿司匹林可通過抑制環(huán)氧化酶使花生四烯酸至前列腺素的代謝通路受阻，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到化學預防和治療的作用。在非COX-2的途徑中，研究表明，阿司匹林可通過調節(jié)B細胞淋巴瘤/白血病（Bcelllymphoma/leukemia，BCL） 家族，c-myc，p53，caspase 等癌基因和抑癌基因，影響細胞凋亡信號的傳導而抑制腫瘤細胞的生長，促進其發(fā)生凋亡。

本研究采用不同濃度的阿司匹林作用于Ishikawa細胞，在不同時間下觀察其對細胞生長的抑制作用。結果顯示，阿司匹林對子宮內膜腺癌Ishikawa細胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，其抑制作用也逐漸增強；同時，阿司匹林能抑制Ishikawa細胞的周期轉換，使細胞停滯在G1期，阻礙G1/S期的轉換，阻止DNA合成，從而阻礙了細胞的分化和進展。透射電鏡下見阿司匹林作用后的細胞發(fā)生皺縮，核染色質邊集，凋亡小體形成，該形態(tài)學變化進一步證明，阿司匹林可觸發(fā)腫瘤細胞內源性死亡即凋亡的發(fā)生。

在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞增殖與凋亡機制的紊亂發(fā)揮著重要的作用。本研究結果顯示，阿司匹林能有效抑制子宮內膜癌細胞的生長和增殖，誘導其發(fā)生凋亡，該藥物有望成為臨床上治療惡性腫瘤的又一重要手段。

［1］Thun MJ，Henley SJ，Patrono C.Nonsteroidal anti-inflammatory drugs as anticancer agents：mechanistic，pharmacologic，and clinical issues［J］.J Natl Cancer Inst，2002，94（4）：252-266.

［2］Huls G，Koornstra JJ，Kleibeuker JH.Non-steroidal anti-inflammatory drugs and molecular carcinogenesis of colorectal carcinomas ［J］.Lancet，2003，362（9379）：230-232.

［3］Donowitz M，Pauker SG.Evaluation for colon cancer in patients with occult fecal blood loss while taking aspirin：a Bayesian viewpoint［J］.Med Decis Making，1982，2（2）：147-160.

［4］Castano E，Dalmau M，Barragan M，et al.Aspirin induce cell death and caspase dependent phosphatidylserine externalization in HT229 human colon adenocarcinoma cell ［J］.Br J Cancer，1999，81（2）：294-299.

［5］Moysich KB，Baker JA，Rodabaugh KJ，et al.Regular analgesic use and risk of endometrial cancer ［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14（12）：2923-2928.

［6］Hector A，Arango MD.Aspirin effects on endometrial cancer cell growth［J］.Obstet Gynecol，2001，97（3）：423-427.

［7］ShiffSJ，KoutsosMI，QiaoL，etal.Non-steriodalanti-inflammatorydrugs inhibit the proliferation of colon adenocarcinoma cell：effects on cell cycle and apoptosis［J］.Exp Cell Res，1996，222（1）：179-188.