初發Graves病患者CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞水平的研究

高桂華，趙連爽

（中國醫科大學 附屬第一醫院檢驗科，沈陽110001）

Graves病（Graves’disease，GD）是一種器官特異性自身免疫病，即突眼性甲狀腺腫。80%患者體內存在抗促甲狀腺激素刺激激素受體抗體（thyrotrophin receptor antibody，TRAb），最顯著的病理組織學特點是甲狀腺、眼睛等效應器官內淋巴細胞的浸潤，浸潤細胞中存在自身反應性T細胞［1］，這些自身反應性T細胞與特異性損傷密切相關，并在Graves病的發生和發展中起重要作用。CD4+CD25+調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）具有免疫抑制功能，能夠抑制CD4+CD25-效應性T細胞的增殖，從而抑制人及實驗動物體內的自身反應性T細胞的增殖［2］。Foxp3（forkhead/winged helix family transcriptional repressor）是最近發現的Tregs的特征性標志［3］。本實驗以胞內染色技術和流式細胞術定量檢測和分析Graves病患者外周血中Tregs的數量和免疫抑制功能變化。

1 材料與方法

1.1 研究對象

45例初發GD患者（GD組，男性13例，女性32例）均來自中國醫科大學附屬第一醫院門診或住院部，所有患者均未經治療，臨床表現為甲狀腺彌漫性腫大，雙眼球突出，代謝亢進，平均年齡40.5歲（27～55歲）。20例健康體檢者（對照組，男性5例，女性15例），平均年齡38歲（24～52歲），無自身免疫疾病及家族史。年齡、性別在兩組之間差異無統計學意義。所有患者及健康體檢者均簽署知情同意書，本研究經中國醫科大學倫理委員會審核批準。

1.2 試劑和儀器

抗CD3-Percp、抗CD4-APCcy7、抗CD25-APC購自BD bioscience，Foxp3-PE kit購自ebioscience。流式細胞儀為BD FACSArial。

1.3 實驗方法

EDTA抗凝管抽取5 ml外周靜脈全血，Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），計數2×106個細胞，加入 CD3、CD4、CD25抗體各10 μl，4℃避光孵育25 min，洗滌2次，加入1ml Fix/permeabilizatioin，4℃避光孵育30 min，Perm Wash2ml洗滌1次，加入20 μl Foxp3抗體，4℃避光孵育25 min，Perm Wash2ml洗滌1次，加入150 μl多聚甲醛固定，上機分析，每個樣本獲取1×105個細胞，所有結果以占CD4+T細胞百分比表示。放射免疫分析法檢測TT3，TT4，TSH，檢測方法按照試劑及儀器說明書。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 甲狀腺激素水平

GD組與健康對照組相比，TT3、TT4水平明顯高于健康對照組，TSH水平低于健康對照組。見表1。

2.2 調節性T細胞水平

GD 組 CD4+CD25+T細胞［（4.9±1.6）%］水平明顯低于健康對照組［（8.9±2.9）%］（P<0.05），CD4+CD25+Foxp3+調節性 T細胞［（3.2±1.7）%］水平明顯低于健康對照組［（6.5±3.6）%］（P<0.05），CD4+Foxp3+T 細胞［（4.6±2.2）%］水平也明顯低于健康對照組［（7.3±4.3）%］（P<0.05）。

3 討論

調節性T細胞是具有調節功能的成熟T細胞亞群，因其具有抑制免疫反應的作用，一直被稱作抑制性T細胞。Treg的種類較多，依據其發育、特異性及作用機制分為天然Treg與獲得性Treg，其中CD4+CD25+Treg是研究較為深入的天然Treg，Treg的特征性的分子標志是Foxp3，它也是Treg不同于活化T細胞的重要特征。

研究顯示在自身免疫性疾病中，調節性T細胞水平明顯下降［4～6］，對GD患者調節性T細胞水平的變化研究尚少，結果也不盡相同，黨珊等［7］發現CD4+CD25+Treg水平下降，而唐大海等［8］則認為GD患者Treg水平無明顯變化，主要是Treg免疫抑制功能的降低。本研究結果顯示GD患者CD4+CD25+Foxp3+Treg水平明顯低于健康成人，與黨珊［7］的結果相似，說明在GD患者發病過程中，具有免疫抑制功能的Treg數量減少，可能在一定程度上對于自身反應性T細胞抑制能力降低，在感染或情緒刺激作用下，自身反應T細胞增殖，促進B細胞產生TSH受體抗體，導致GD的發生。

綜上，GD患者CD4+CD25+Foxp3+Treg水平明顯低于健康成人，提示在GD發病及發展中調節性T細胞可能發揮重要作用，這對于闡明GD的機制可能具有很大意義。進一步，在GD發病早期我們可以通過減慢或阻止Treg數量減少來延緩GD的發展，為治療GD提供了一種新的思路與可能。

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［7］黨珊，施秉銀.Graves病患者CD4+CD25+調節性T細胞的變化［J］.中華內分泌代謝雜志，2007，23（3）：253-254.

［8］唐大海，徐爾理，吳玲.Graves病患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞的定量及功能分析［J］. 海軍醫學雜志，2008，29（2）：114-118.