ErbB2高表達的人乳腺癌原位移植瘤裸鼠模型的建立

沈國棟，趙 婷，張安莉，凌 斌，劉 兢，宋禮華，，魏 偉

ErbB2/HER2是細胞生長因子受體(EGFR)家族中的重要成員，它在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中的高表達預示腫瘤易發生轉移及預后不良，且與放化療、內分泌治療抵抗高度相關［1－3］。由于ErbB2表達于腫瘤細胞的表面，而在成人正常組織中不表達或者僅有極低表達，使得它成為一個良好的藥物靶點。第一個抗ErbB2的人源化單克隆抗體藥物曲妥珠單抗(trastuzumab，商品名Herceptin)在10余年的臨床治療中展示了獨特的功效，然而還存在單藥有效率低及大部分初始接受曲妥珠單抗治療有效的病人常在1年內產生耐藥的現象，這促使人們不斷研究與開發針對ErbB2受體的治療藥物［4］。

本實驗室在國內較早開展了這方面工作，對制備的抗ErbB2鼠源性單克隆抗體A21進行人源化改造得到了嵌合抗體chA21，前期實驗發現它具有特異性地抗ErbB2高表達的腫瘤的作用，并能夠提高腫瘤細胞對紫杉醇等化療藥物的敏感性［5－7］。為了尋找一種適于進行chA21等抗體藥物藥效評價的人乳腺癌移植瘤模型，本研究分別采用乳房墊內原位接種、脅部皮下及腋窩接種3種方法制備了BT-474細胞的裸鼠移植瘤模型，并對它們在腫瘤生長與ErbB2受體表達等方面進行了比較。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 裸鼠(BALB/c-nu/nu)購于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(滬)2009－0002，SPF級，32只，♀4～5周齡;飼養于中國科技大學SPF級動物房中，按中國科技大學實驗動物倫理委員會批準的方案進行實驗。

1.2 細胞系 人乳腺浸潤性導管癌細胞株BT-474，購自美國ATCC，接種前經流式細胞儀檢測其細胞表面高表達ErbB2受體。

1.3 試劑 免疫組化方法檢測用的ErbB2試劑盒HercepT-est購于丹麥Dako公司，BrdU、VEGF試劑盒購于北京中杉公司，Ki-67、CD31、CD34試劑盒購于武漢博士德公司;17β雌二醇60天緩釋片購于美國IRA公司;matrigel膠購于德國BD公司;RPMI 1640培養液及胎牛血清購于美國Gibco公司。

1.4 腫瘤細胞接種 36只裸鼠隨機分為乳房墊內原位接種和脅部皮下接種二組，接種前1 d均在頸部皮下埋植0.5 mg 17β雌二醇緩釋片，然后將處于對數生長期的BT-474細胞經胰酶消化，以無血清1640培養液洗滌，調整活細胞濃度為5×1010·L－1，取0.1 ml細胞懸液與matrigel膠1 ∶1 混勻后，分別接種于裸鼠左側第二乳房墊內或者脅部皮下，次日記為接種第1天。

1.5 腫瘤體積測量與給藥處理 腫瘤細胞接種后，每周2次用游標卡尺測量腫瘤長徑(L)和短徑(W)，腫瘤體積(TV)的計算公式為:TV=0.5×L×W2。計算每組裸鼠的移植瘤體積平均值和標準方差。為考察制備的裸鼠原位移植瘤模型對抗ErbB2抗體處理的反應，在腫瘤細胞接種第2周后荷瘤裸鼠隨機分為3組，每組7只，分別按下述方法給藥處理:生理鹽水對照組注射劑量為10 g·kg－1，曲妥珠單抗組注射劑量為20 mg·kg－1，chA21組注射劑量為30 mg·kg－1，紫杉醇組注射劑量為10 mg·kg－1，各組均采用尾靜脈注射給藥，除紫杉醇組給藥頻率是每周1次外，其余組為每周2次，連續5周，實驗結束時稱量各組裸鼠所荷腫瘤質量。

1.6 免疫組化檢測與結果判斷 自全部成瘤日起每2周處死3只裸鼠，摘取移植瘤，福爾馬林固定，石蠟包埋，進行免疫組化染色SP法，DAB顯色，蘇木精復染。每張切片按試劑盒說明書加入適當比例的一抗如ErbB2(即用型)、Ki-67(1 ∶100)、VEGF(即用型)、CD31(1 ∶100)等抗體，并用 PBS代替一抗作為陰性對照。二抗采用辣根過氧化物酶標記，然后加新鮮配制的DAB溶液進行顯色。ErbB2染色結果判定根據美國臨床腫瘤學會(ASCO)和美國病理家協會(CAP)2007年發布的《ErbB2檢測臨床實踐指南》標準，細胞膜棕黃色的染色結果被分為0～+++(四級):染色為+++，即＞30%浸潤性癌細胞膜呈全周的強著色代表ErbB2陽性表達;染色為，即指至少10%腫瘤細胞有完整的胞膜染色，但是不均勻或強度較弱代表結果不確定;染色為0或+，即任何比例的腫瘤細胞有微弱的、不完整的膜染色或無著色代表ErbB2陰性表達。Ki-67、VEGF標記結果根據試劑盒說明書，以切片中細胞核或細胞質中出現棕黃色顆粒者為陽性細胞。CD31標記微血管，參考文獻［8］的判斷標準，凡呈現棕色單個內皮細胞或內皮細胞簇均作為一個血管計數。

1.7 統計學分析 所有數據均使用統計軟件SPSS 12.0處理;方差分析后進行q檢驗。

2 結果

2.1 成瘤率和成瘤時間 采用乳房墊內原位接種的裸鼠1周后全部長出體積大于100 mm3的腫瘤，且形狀、大小較整齊;而脅部皮下與腋窩接種的裸鼠1周后的成瘤率雖然也為100%，但形狀和大小不一致，腫瘤平均體積也明顯小于原位組(P ＜0.05，Fig 1)。

2.2 腫瘤生長曲線 3組裸鼠均從接種后1周起，統計每周的腫瘤體積做腫瘤生長曲線。如Fig 2所示，乳房墊內原位接種的裸鼠移植瘤第1周至第2周生長平穩，從第3周起生長迅速，且所有腫瘤生長速度較一致;相比而言，脅部皮下與腋窩接種7周后的腫瘤平均體積明顯小于原位組(P＜0.05)，而且組內腫瘤體積差異很大，提示這兩種方法接種形成的腫瘤生長速度不一致。

2.3 腫瘤的病理組織學特點 3組移植瘤切面均為灰白色、半透明、質實的實性區。HE染色后觀察，組織內微血管多見，腫瘤細胞大，不規則團塊狀排列，細胞胞質豐富，細胞核大小不一，深染，核分裂相多見，核仁清楚(Fig 3 HE);進一步采用免疫組化染色方法對腫瘤切片中細胞增殖標志物Ki-67及新生血管標記分子VEGF與CD31進行了檢測，代表性結果如Fig 3所示，Ki-67、VEGF與CD31分子均呈陽性表達，提示移植瘤具有細胞增殖活躍、血管生成能力強的特點。通過對這些標記分子的量化分析，結果如Fig 4所示，原位組移植瘤組織中VEGF表達的細胞數明顯高于脅部皮下和腋窩組(P＜0.05)，Ki-67表達的細胞數與微血管密度(microvessel density，MVD)雖和脅部皮下及腋窩組之間的差異無顯著性(P＞0.05)，但標準方差明顯增加，提示原位組腫瘤和對照組相比，其病理組織學特點也更為一致。

Fig 1 The xenograft volume of BT-474 cell inoculation by three methods after 1 week

Fig 2 Tumor growth curve of BT-474 xenografts prepared by three methods*P＜0.05 vs flank or axilla group

Fig 3 The pathological observation of BT-474 xenografts

Fig 4 Quantification of expression of Ki-67，VEGF and MVD of BT-474 xenografts prepared by two methods*P＜0.05 vs flank or axilla group

2.4 腫瘤的ErbB2表達情況及對治療藥物的反應 對3組移植瘤的ErbB2表達進行動態監測，光學顯微鏡下觀察免疫組化染色的移植瘤切片，可見ErbB2陽性染色細胞膜定位準確，條狀棕色或深棕色帶清晰環繞整個腫瘤細胞細胞膜(Fig 5)。根據材料與方法中描述的ErbB2表達判定標準予以評分，結果發現，3組移植瘤組織ErbB2表達均為陽性(染色為+++)，且在動態監測期間表達穩定，提示我們制備的BT-474細胞移植瘤保持了ErbB2陽性表達的生物學特性。為考察制備的裸鼠原位移植瘤模型對抗ErbB2抗體處理的反應，我們在人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型上分別進行了抗ErbB2抗體曲妥珠單抗和chA21的藥效學實驗，連續給藥5周后，結果發現chA21、曲妥珠單抗和紫杉醇處理組的腫瘤質量分別是注射生理鹽水對照組質量的63%、42%及19%，單藥處理組與對照組之間差異均有統計學意義(P＜0.01，Fig 6);表明制備的裸鼠原位移植瘤模型對治療藥物有著良好的反應性，適合我們進行工程抗體chA21等藥物的藥效評價。

Fig 5 ErbB2-positive expression of BT-474 xenografts by IHC method

3 討論

Fig 6 Decreased weight of BT-474 xenografts treated by chA21，PTX or TraPTX:paclitaxel;Tra:trastuzumab.＊＊P＜0.01 vs control

裸鼠是一種先天性T、B細胞功能缺陷的實驗動物，具有移植瘤容易成活、價格相對便宜等優點，而成為目前最常使用的實驗動物之一。在多數裸鼠移植瘤保持原發腫瘤特性的同時，研究也發現有少數移植瘤生物學特性發生了改變，如人肺癌移植瘤與原發腫瘤相比，α1-抗胰蛋白酶、促腎上腺皮質激素、鐵蛋白、癌胚抗原、降鈣素等標記物丟失［9］。雖然采用BT-474細胞株建立的荷瘤裸鼠模型已有報道［10］，但其細胞接種部位為頸部皮下，而此部位同時需要埋置雌激素緩釋片，從而影響移植瘤的生長及其體積的測量;另外該部位與人乳腺癌發生的微環境也相差甚遠，為此我們采用乳房墊內原位接種BT-474細胞建立了人乳腺癌裸鼠移植瘤模型，并以脅部皮下和腋窩兩種接種部位作為對照，對其移植瘤的生長速度、一致性及ErbB2表達等特點作了比較。結果發現乳房墊內原位組比對照組的移植瘤生長更為快速、一致，且高表達ErbB2的生物學特性保持穩定。鑒于Ki-67是一種增殖細胞相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關，Ki-67陽性表達表明癌細胞增殖活躍［11］;而血管生成使腫瘤能夠獲得足夠的營養物質，是促成腫瘤快速生長與侵襲轉移的關鍵環節［12－13］;通過對各組移植瘤上述標志物表達的比較，結果證實原位接種形成的移植瘤病理組織學的一致性也好于對照。

實際建模過程中，我們發現為了建立成瘤率高、成瘤齊、腫瘤大小一致的荷瘤裸鼠，還要注意以下幾點:(1)激素水平:BT-474為人乳腺癌細胞株，因此選用♀裸鼠，但BT-474細胞株需要與matrigel膠混勻接種及外源添加雌激素才能在裸鼠體內成瘤;然而在雌激素藥物的選擇上也要多加注意，我們通過實驗發現苯甲酸雌二醇、戊酸雌二醇及己烯雌酚等短效雌激素雖能促進BT-474移植瘤生長，但不容易掌握給藥劑量與時間間隔，血藥濃度低則達不到促進生長的效果，高了易造成小鼠靶器官中毒甚至導致死亡。參照文獻［10］方法，在裸鼠頸部皮下埋置0.72 mg 17β雌二醇60 d緩釋片，結果發現該劑量緩釋片埋置1個月后可致小鼠出現體重下降，影響藥物安全性評價;研究發現埋置的17β雌二醇60 d緩釋片劑量減至0.5 mg效果更好。(2)動物年齡:裸鼠并非毫無免疫力，與普通小鼠相比甚至有更高的NK細胞比例，且其NK細胞數隨年齡增長而增加，4～5周齡NK細胞開始顯示細胞殺傷作用，至4～5月齡達到高峰［14］。因而選擇5周左右的裸鼠腫瘤移植成功率較高。(3)實驗環境:裸鼠接觸到病原微生物可能造成感染死亡，病毒、細菌等抗原刺激可能激活非T細胞依賴免疫活性造成移植成功率降低，因此飼養和實驗過程中要嚴格無菌操作。(4)接種部位:不同接種部位成瘤率不同，本研究通過對裸鼠脅部皮下、腋窩以及乳房墊3個接種部位的比較，發現BT-474細胞接種于乳房墊內效果最好，具有成瘤早、生長快且形狀均勻等優點，這可能和乳房墊具有天然的囊狀結構以及微血管豐富等特點有關。

綜上所述，我們建立了ErbB2高表達的人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，這為工程抗體chA21等治療藥物進行藥理作用的研究提供了一個很好的實驗平臺。

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