2-DG增強乳腺癌細胞對阿霉素化療敏感性的作用

程 秀，劉 浩，方 琳，蘇 方，宋樂樂，馬琳艷，蔣國君，張旭東，蔣志文

乳腺癌是一種嚴重危害女性身心健康的惡性腫瘤，發病率在全球范圍內位居女性惡性腫瘤的首位，并以每年2%的速度遞增。全球每年新增病例120萬，死亡病例50萬，據估計到2010年全球每年新增病例將達150萬人［1］。以手術為主，配合化療、放療、內分泌療法、免疫療法及中醫藥療法的綜合治療措施，是目前治療乳腺癌高效低毒的優化方案［1-2］。但是腫瘤對大多數化療藥耐藥，對化療藥引起的細胞凋亡不敏感，因此，研究其耐藥機制、克服化療耐藥，發現新的治療靶點是腫瘤研究的熱點之一［3-4］。本研究觀察了糖基化抑制劑2-DG對乳腺癌細胞增殖及凋亡的影響，并聯合臨床常用治療乳腺癌的藥物阿霉素，檢測2-DG增強ADM誘導乳腺癌細胞凋亡的作用，并對其初步機制進行探討，以期為乳腺癌的臨床治療提供新的思路和方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 細胞系Sk-Br-3(購于美國ATCC公司)，由蚌埠醫學院生化藥理研究室凍存培養。

1.1.2 試劑 DMEM高糖培養基、胰蛋白酶、Hepes、新生牛血清:Gibco公司。2-DG:Sigma公司;阿霉素:浙江海正藥業股份有限公司;Caspase-3檢測試劑盒:碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 乳腺癌腫瘤細胞采用DMEM高糖培養液，10%(V/V)FBS，100 U·ml-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素，37℃、5%CO2飽和濕度下培養。

1.2.2 MTT 將細胞按每孔200 μl(含1×104個細胞)種于96孔板，每5孔為一組，每種藥取5個質量濃度，各組藥物終濃度如下，ADM:0.625、1.25、2.5、5、10 mg·L-1。另設陰性對照組(不加藥物)和空白對照組(不加細胞，只加培養基)。終止培養前4 h，每孔加MTT 20μl(5 g·L-1)，加藥后24～72 h(藥物作用終點時間)終止培養，棄去上清液，加入二甲亞砜200 μl每孔，微量振蕩器搖震5 min，全自動定量繪圖酶標儀測定每孔的595 nm波長吸光度A值，各藥重復試驗3組。

1.2.3 溴化丙啶(propidium iodide，PI)染色檢測細胞凋亡 將對數生長期細胞制成單細胞懸液接種于24孔細胞培養板，每孔1×105個細胞，培養16～24 h后按實驗設計加入藥物，繼續培養48h收集各孔培養液至對應流式管中，用預冷的PBS 500 μl清洗培養孔，收集清洗液至對應培養液中，1 200 r·min-1，離心10 min，棄上清;培養板中加入PI緩沖液(5 mg PI，0.1 g 檸檬酸鈉、100 μl TritonX-100、100 ml dH2O)750 μl/孔，37℃ 孵育 10 min，吹打收集細胞至對應流式管中，輕輕搖動混勻。4℃避光保存，過夜，上流式細胞儀檢測。利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數。

1.2.4 Caspase-3活性檢測 按照說明書進行檢測，反應溫度為 37℃。取樣本 100 μl，Ac-DEVDAMC(Caspase-3四肽熒光底物)10 μl加到HEPES緩沖液中，在37℃下作用1 h，應用熒光分光光度計在波長405 nm處測吸光度，以不加底物的樣本作空白，結果以吸光度值表示。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達 收集穩定表達細胞用細胞裂解液(總體積200 ml:100 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.4 20 ml、1 mol·L-1NaCl 28 ml、100 mmol·L-1CaCl21 ml、100 mmol·L-1MgCl221 ml、15 mmol·L-1NaN340 ml、Triton X-100 2ml，用前加入蛋白酶抑制劑 12 μmol·L-1Leupeptin、1 mmol·L-1PMSF各2 ml·L-1)冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量法(參照試劑盒說明書操作)測各組蛋白濃度，用細胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮沸5 min蛋白變性。取蛋白 30 μg/組，10%SDS-PAGE凝膠電泳(70 V，30 min;150 V，90 min);轉膜(50 V，90 min)至硝酸纖維素膜;5%脫脂牛奶室溫封閉2 h(或4℃過夜);一抗:1∶250，室溫孵育2 h(或4℃過夜);TPBS洗滌3次;二抗:1∶2500，室溫孵育2 h;TPBS洗滌3次，PBS洗滌1次;ECL發光試劑盒暗室發光、顯影、定影。Bio-Rad凝膠成像系統獲取圖像。

1.2.6 集落克隆實驗 用含體積分數10%FBS的培養基調整細胞濃度后，分別以每孔800個細胞接種于6孔板中，24 h后加0.132 mg·L-1ADM，1 mmol·L-12-DG以及兩者合用處理乳腺癌細胞，置CO2孵箱中培養d 5，觀察到細胞集落形成后，去除培養基，PBS洗滌2遍，20%甲醇 -20℃固定10 min，結晶紫染色，集落形成率的降低證實，2-DG增加ADM對乳腺癌細胞Sk-Br-3的增殖抑制作用。

2 結果

2.1 2-DG增強ADM對乳腺癌細胞Sk-Br-3增殖的抑制作用 為觀察2-DG抑制乳腺癌細胞Sk-Br-3增殖的作用及對ADM抑制乳腺癌細胞增殖作用的影響，實驗中使用不同濃度的2-DG刺激細胞，并聯合ADM，使用MTT法檢測細胞存活率。結果表明，10 mmol·L-12-DG作用于乳腺癌細胞Sk-Br-3的24、48、72 h 的存活率分別為 80.73%、57.16%、70.10%。ADM作用于乳腺癌細胞Sk-Br-3的24、48、72 h增殖抑制率分別為 76.89%、76.79%、70.07%。10 mmol·L-12-DG對 0.625 mg·L-1ADM誘導乳腺癌細胞Sk-Br-3 24、48、72 h的存活率分別為67.18%、67.52%、67.13%。ADM、2-DG與2-DG誘導ADM乳腺癌細胞增殖抑制率差異有統計學意義(P＜0.05)，見Fig 1。

2.2 2-DG增強ADM誘導乳腺癌細胞Sk-Br-3凋亡的作用 實驗中對不同因素處理的細胞進行PI染色，并通過流式細胞儀分析，觀察藥物誘導乳腺癌細胞凋亡的作用，結果見Fig 2。10 mmol·L-12-DG刺激48h，誘導乳腺癌細胞 Sk-Br-3的凋亡率為5.8%(Fig 2B)，與陰性對照組0.16%比較差異無統計學意義(P＞0.05，Fig 2A)。0.4 mg·L-1ADM 誘導乳腺癌細胞Sk-Br-3 48 h的凋亡率為35.12%(Fig 2C)。10 mmol·L-12-DG 對 0.4 mg·L-1ADM誘導乳腺癌細胞Sk-Br-3 48 h的凋亡率為58.11%(Fig 2D)，與2A及2B比較差異有統計學意義(P＜0.05)。上述表明，2-DG本身并不誘導細胞凋亡，但可以增強阿霉素誘導的乳腺癌細胞凋亡。

Fig 1 MTT conversion after treated with 2-DG，ADM and 2-DG combination with ADMSk-Br-3 cells were incubated with the indicated concentrations of 2-DG，ADM and 2-DG combination with ADM for 24 h，48 h and 72 h.MTT was added the amount of reduced formazan product determined spectrophotometrically.Results are expressed as percent of control non-treated cells.

Fig 2 ADM-induced Sk-Br-3 apoptosis was increased by 2-DGA，B and C show that Sk-Br-3 cells were treated with 2-DG(10 mmol·L-1)，ADM(0.4 mg·L-1)and 2-DG+ADM for 48 h.Sub-G1 populations among the Sk-Br-3 cells were counted by FACS，and the data are expressed as the ˉx± s for the three determinations in triplicate(*P ＜0.05 vs control).

2.3 2-DG增強ADM對乳腺癌細胞Sk-Br-3的集落克隆形成的抑制作用 為進一步觀察2-DG抑制乳腺癌細胞Sk-Br-3增殖的作用及對ADM抑制乳腺癌細胞Sk-Br-3增殖作用的影響，實驗中使用1 mmol·L-12-DG刺激細胞，并聯合0.1 mg·L-1ADM，使用集落克隆形成實驗檢測乳腺癌細胞Sk-Br-3增殖作用的影響。Fig 3中，A、B、C、D分別是空白對照組、1 mmol·L-12-DG、0.1 mg·L-1ADM和1 mmol·L-12-DG+0.1 mg·L-1ADM處理Sk-Br-3細胞，給藥處理5 d后，20%甲醇-20℃固定10 min，結晶紫染色。結果表明，2-DG在低濃度即可明顯抑制Sk-Br-3細胞的集落克隆形成，并可增強ADM的抑制作用。

Fig 3 2-DG increased the colony formation inhibited effect of ADM on Sk-Br-3 cellsB，C and D:Sk-Br-3 cells were treated with 1 mmol·L-12-DG，0.1 mg·L-1ADM and 1 mmol·L-12-DG+0.1 mg·L-1ADM for five days.

2.4 2-DG增強ADM誘導乳腺癌Sk-Br-3細胞的Caspase-3激活作用 為觀察2-DG誘導乳腺癌細胞Sk-Br-3的Caspase-3的活性改變及對ADM誘導乳腺癌細胞Sk-Br-3的Caspase-3的活性增加的影響，根據Caspase-3活性試劑盒檢測Caspase-3活性，結果表明:2-DG刺激細胞后，并未出現Caspase-3的激活，但2-DG對ADM誘導乳腺癌細胞Sk-Br-3的Caspase-3激活有明顯的增強作用(P＜0.01)。

2.5 2-DG 對ADM誘導的Sk-Br-3的GRP-78及Caspase-3蛋白表達的影響 Sk-Br-3給予不同的刺激后收集蛋白，Western blot檢測 GRP-78以及Caspase-3蛋白的表達，從Fig 5可以看出，2-DG可誘導GRP-78表達，隨時間延長，GRP-78的表達不斷增強。2-DG聯合ADM處理Sk-Br-3細胞后，可誘導更為明顯的GRP-78的表達。2-DG本身并未誘導Caspase-3蛋白的表達，聯合ADM后激活型的Caspase-3蛋白表達明顯增加。

3 討論

糖基化抑制劑2-DG的抗腫瘤作用被廣泛關注，從培養細胞到實驗動物，以及臨床實驗不斷的開展，并針對單獨抗腫瘤到與其他抗腫瘤藥物聯合應用方面進行探索。同其他腫瘤一樣，乳腺癌必須依賴于對葡萄糖攝取的增加來維持自身的快速增殖。本次研究觀察了2-DG增強ADM抗乳腺癌的作用。從上述的結果可以看出，2-DG可增加ADM對乳腺癌細胞Sk-Br-3的增殖抑制作用，增強其誘導的腫瘤細胞凋亡;2-DG還可增高ADM誘導乳腺癌細胞Sk-Br-3的GRP-78表達，引起內質網應激反應，并增強Caspase-3蛋白的表達。

Fig 4 2-DG enhanced ADM induced activation of casepase-3 in Sk-Br-3Cells treated with 2-DG(10 mmol·L-1)，ADM(0.4 mg·L-1)，2-DG+ADM.Sk-Br-3 cells were treated with 10 mmol·L-12-DG，0.4 mg·L-1ADM，2-DG+ADM for 6 h.Cells were harvested and Caspase-3 activity measured using a spectrophotometric assay according to the manufacturer′s instructions.Control cells were incubated for 6 h in the presence of media only.＊＊P＜0.01 vs 2-DG

Fig 5 Expressions of GRP-78 and Caspase-3 in Sk-Br-3 cellsA:2-DG induced activation of UPR in Sk-Br-3 cells;B:2-DG+ADM induced activation of UPR in Sk-Br-3;C:2-DG activation Caspase-3 in Sk-Br-3 cells.

葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP-78)是內質網(endoplasmic reticulum，ER)功能的中心調節者，由于其在蛋白質折疊、聚集、促進非折疊蛋白降解、ER Ca2+連接和控制ER跨膜感受器的激活等過程中具有重要作用，因此GRP-78的誘導被廣泛用作ER應激和UPR啟動的生物標記［5-6］。體外研究顯示［7］，腫瘤細胞程度性地合成GRP-78維持內環境的穩定，構筑自身防御機制。在生長環境惡劣的腫瘤微環境中，乳腺癌細胞自身發生ER應激激活UPR。給予2-DG時可影響腫瘤細胞對葡萄糖的攝取，降低ATP的產生，抑制腫瘤細胞增殖。實驗結果中發現，2-DG可誘導乳腺癌細胞的ER應激，GRP-78表達明顯增強，啟動劇烈的UPR。由于ER應激的保護作用，削弱了細胞凋亡反應的發生，因此乳腺癌細胞對能夠激活UPR的化療藥物介導的細胞凋亡不敏感。GRP-78的高表達則是乳腺癌細胞對ER應激途徑的化療藥耐藥的原因之一。可見，2-DG上調 GRP-78的表達可能是Sk-Br-3細胞對2-DG誘導的細胞凋亡不敏感的原因之一。但必須強調的是，UPR本身是一種細胞保護反應，但過度的UPR最終啟動細胞凋亡進程［8］。因此，觸發腫瘤細胞產生過強的ER應激反應，促使UPR保護機制無法產生抗凋亡作用，而激活下游Caspase的活性，實現腫瘤細胞的凋亡。本研究中發現，2-DG本身誘導乳腺癌細胞產生明顯的ER應激反應，使得乳腺癌細胞Sk-Br-3僅出現增殖的抑制，而不誘導明顯的凋亡作用，ER應激反應可能發揮保護作用，當其與ADM聯合應用時，出現乳腺癌細胞凋亡明顯增加，UPR機制并沒有保護腫瘤細胞免于凋亡。檢測ER應激標記物的結果發現，2-DG與ADM共同作用下，觸發了更為強烈的ER反應，通過檢測凋亡通路中Caspase-3活性的改變，也說明了凋亡的增加。這些結果說明了過度的ER應激可促使UPR從細胞保護轉變成促進凋亡的現象存在。當然，關于ER應激的不同程度對腫瘤細胞的存活的影響尚需更多的實驗進行說明［9］，這也是本研究需要進一步深入探討的問題，而本次研究恰為深入認識ER應激提供了一定的實驗基礎。

2-DG與葡萄糖結構的差別在于由氫替代第2個碳的羥基。而且2-DG有選擇性地積聚在腫瘤細胞代謝中，這個可能歸咎于提高了腫瘤細胞內的己糖激酶或細胞內磷酸化活性以及減少細胞內的磷酸鹽的水平［10-11］。葡萄糖類似物2-DG可競爭葡萄糖的轉運，抑制其吸收代謝，并降低 ATP產生［11-12］。體外和體內的實驗均證實了葡萄糖類似物能抑制腫瘤細胞的葡萄糖代謝［13］。2-DG已被廣泛研究作為一種可能的靶向治療劑來治療腫瘤，或者用來增強其他抗腫瘤藥物的治療效果［14-15］。乳腺癌和其他腫瘤細胞一樣，都依賴于增加葡萄糖攝取，以維持細胞的生長，表現為葡萄糖攝取率增加并且葡萄糖轉運蛋白表達增強。最近的研究表明［11］，干擾糖酵解的非代謝葡萄糖類似物2-DG能通過干預糖酵解導致細胞死亡。2-DG能否調高臨床腫瘤治療療效的研究也在不斷深入，例如，2-DG可通過提高細胞表面TRAIL-R2的表達，而增強TRAIL誘導的黑色素瘤細胞的凋亡［16］;2-DG還具有協同放射治療增強乳腺癌細胞死亡的作用。本實驗中發現了2-DG對乳腺癌細胞的增殖具有抑制作用，在聯合臨床常用抗腫瘤藥物ADM時，證明了其增強ADM誘導乳腺癌細胞凋亡的作用。

總之，本研究證實了糖基化抑制劑2-DG對乳腺癌細胞的增殖具有抑制作用，但其本身并不誘導細胞凋亡，但可明顯增加臨床常用治療乳腺癌細胞的藥物誘導乳腺癌細胞凋亡的作用。其機制可能是通過誘導細胞產生過度的ER應激反應，增強Caspase-3活性而發揮作用。本研究為糖基化抑制劑的臨床應用提供了實驗基礎，也為增強臨床常用化療藥物療效提供了一個良好的策略。但本實驗中僅選用了體外培養的細胞株進行觀察，進一步的體內外藥效及機制有待深入研究。

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