硫化氫對大鼠急性心肌缺血損傷后心功能的影響

劉 芳，張建新，，李蘭芳，丁艷艷，張新艷

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)的毒性作用很多年前就已被人們所認識，但近年來隨著人們對H2S研究的逐漸深入發現［1－2］它在機體內發揮著廣泛的生物學效應，是繼一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后的第3種新型氣體信號分子。它作為氣體小分子，具有持續產生、迅速傳播和快速彌散等特點，在神經、心血管、消化和免疫等多個系統發揮著重要的生理及病理生理調節作用。越來越多的研究顯示［3－7］在不同實驗模型中內源性和外源性硫化氫均可發揮對心臟缺血/再灌注損傷的保護作用，而H2S在急性心肌缺血中的作用尚無定論。本研究旨在通過建立大鼠急性心肌缺血模型，觀察H2S/CSE體系在大鼠急性心肌缺血時的變化及其對缺血心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物與藥品 ♂SD大鼠(250～300 g)由河北省實驗動物中心提供。NaHS和PPG均購自美國Sigma公司;其余均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型制備 健康♂SD大鼠48只，體質量250～300 g，隨機分為6組:① 假手術組(sham)、② 缺血組(ischemia)、③ 缺血+NaHS低劑量組(I+L NaHS)、④缺血+NaHS中劑量組(I+M NaHS)、⑤ 缺血 +NaHS高劑量組(I+H NaHS)、⑥ 缺血+PPG組(I+PPG)，每組8只。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg·kg－1)麻醉后取仰臥位固定;消毒后沿胸骨左緣3、4肋間開胸，剪開心包膜，暴露心臟，輕壓胸壁將心臟擠出，在室間溝處左心耳下方穿線，結扎左冠狀動脈前降支后將心臟回納入胸腔，記錄心電圖，觀察ST段的改變，ST段抬高≥0.15 mV表示造模成功。假手術組:只穿線不結扎;缺血組:于術后3 h時腹腔注射生理鹽水(2 ml·kg－1);缺血 +NaHS 低、中、高劑量組:分別于術后 3 h時腹腔注射0.78、1.56、3.12 mg·kg－1的NaHS(用前半小時生理鹽水新鮮配置，均為2 ml·kg－1)，缺血+PPG組于術后3 h時腹腔注射30 mg·kg－1的 PPG(2 ml·kg－1)。各組動物均在術后6 h時經右頸動脈插管入左心室，并連接到Powerlab/8 s八導生理記錄儀上，測定心率(HR)、左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內壓上升/下降最大速率(±dp/dtmax)，并計算左室發展壓(LVDP，LVDP=LVSP－LVEDP)。經右頸總動脈取血后處死、取材備用。

1.2.2 血漿中H2S含量的測定 采用去蛋白的方法測定［8］。在預先準備好的試管中加入0.5 ml 1%醋酸鋅后加入0.1 ml血漿標本，振蕩混勻，再依次加入0.5 ml 20 mmol·L－1對苯二胺鹽酸鹽和0.5 ml 30 mmol·L－1三氯化鐵，室溫孵育 20 min，使之充分顯色。加入1 ml 10%三氯醋酸，用蒸餾水補足體積至5 ml。6 000 r·min－1離心 5 min，吸取上清液，測上清液在670 nm波長處的吸光度值，根據NaHS標準曲線計算血漿中H2S的含量，結果以μmol·L－1表示。

1.2.3 心肌組織中CSE活性的測定 采用亞甲基藍方法［9］，取左心室前壁部分組織，在預冷的生理鹽水中洗去殘血，濾紙吸干。電子天平分別稱量所取心肌組織質量，按10%質量體積比(W/V)加入預冷的磷酸鉀緩沖液(50 mmol·L－1，pH=6.8)，用電動勻漿器制將其成勻漿后于4℃、4 000 r·min－1離心10 min，吸取上清0.3 ml做為反應液，測定心肌組織CSE活性。用分光光度計在波長670 nm處檢測各樣本反應后的吸光度值，組織中CSE活性以每毫克組織在單位時間內生成H2S的量表示，單位為μmol·min－1·g－1。

2 結果

2.1 實驗前后心電圖改變 實驗前大鼠心電圖基本正常，結扎冠狀動脈后ST段明顯抬高，ST段抬高≥0.15 mV表明急性心肌缺血模型成立。

2.2 H2S對大鼠心功能的影響 與假手術組比較，缺血組大鼠心功能指標HR、LVDP、±dp/dtmax明顯降低，LVEDP明顯升高(P＜0.01)。與缺血組比較，缺血+NaHS低劑量組大鼠心功能指標LVDP升高;缺血+NaHS中、高劑量組大鼠心功能指標 HR、LVDP、±dp/dtmax明顯升高，LVEDP明顯降低;缺血+PPG組大鼠心功能指標HR、LVDP、±dp/dtmax明顯降低，LVEDP明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。與缺血+NaHS低劑量組比較，缺血+NaHS中、高劑量組大鼠心功能指標LVDP、±dp/dtmax明顯升高;缺血+NaHS高劑量組大鼠HR明顯升高，LVEDP明顯降低，(P＜0.05)。與缺血組+NaHS中劑量比較，缺血組+NaHS高劑量組大鼠心功能指標HR、LVDP、±dp/dtmax明顯升高，LVEDP明顯降低(P＜0.05)。即隨著NaHS的劑量增加，急性心肌缺血后大鼠心功能逐漸改善(Fig 1)。

2.3 大鼠H2S/CSE體系變化 與假手術組比較，缺血組大鼠血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性降低(P＜0.01);與缺血組比較，缺血大鼠血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性均升高;而缺血+PPG組大鼠血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性均降低(P＜0.05或P＜0.01)。與缺血組+NaHS低劑量比較，缺血組+NaHS中、高劑量組大鼠血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性均升高;與缺血組+NaHS中劑量比較，缺血組+NaHS高劑量組大鼠血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性均升高(P＜0.05)。即隨著NaHS的劑量增加，急性心肌缺血后大鼠血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性逐漸升高(Fig 2)。

3 討論

近年來人們發現哺乳動物的許多細胞和組織都會產生H2S，它是一種新型氣體遞質，在機體內發揮著廣泛的生物學效應，其主要由L-半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶(CBS)和(或)胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的作用下生成［10］。生理狀態下，SD大鼠血漿中的H2S 水平為 ～46 μmol·L－1［11］。H2S 可獨自或與另外兩種氣體遞質NO、CO共同調節一系列生理過程，并在許多疾病的發病機制中具有重要作用，如神經變性疾病、糖尿病、心臟病等［12］。有研究顯示［13］胰島素抵抗的大鼠體內H2S/CSE體系受到抑制，這是其形成高血壓的重要因素，外源性給予H2S有助于緩解高血壓。此外，內毒素性急性肺損傷時大鼠體內H2S/CSE體系下調，外源性補充H2S可減輕內毒素性急性肺損傷［14］。

在本研究中我們通過建立大鼠急性心肌缺血模型，觀察H2S供體NaHS對急性心肌缺血損傷的保護作用。H2S對缺氧/復氧損傷的心臟保護作用已在細胞、離體和在體模型中得到證實，并且可減少心肌細胞壞死和凋亡，該作用機制可能與KATP通道開放有關［5－6，15－19］。阿霉素誘導的心肌病可能與內源性H2S生成減少有關，H2S可減弱脂質過氧化作用，增強抗氧化作用，抑制氧化應激損傷，從而起到保護心肌的作用［20］。本研究中我們首次證實H2S/CSE體系在急性心肌缺血中的作用，結果顯示急性心肌缺血后，大鼠 HR、LVDP、±dp/dtmax明顯降低，LVEDP明顯升高，即心臟發展張力降低，靜止張力升高，心肌收縮功能下降，心功能障礙;并且血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性均降低。這些均表明急性心肌缺血時CSE活性降低，H2S生成減少，提示H2S/CSE體系可能參與了急性心肌缺血的發生與發展過程。

Fig 1 Effect of H2S on cardiac function in rats(n=15)

Fig 2 Changes of the content of H2S in plasma and the activity of CSE in myocardial tissue of rats(n=8)Note see Fig 1.＊＊P ＜0.01 vs sham;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ischemia;△P ＜0.05 vs I+L NaHS;▲P ＜0.05 vs I+M NaHS.

我們根據相關文獻［14，16－17］以及前期實驗和預實驗結果，分別在急性缺血3 h后腹腔注射0.78、1.56、3.12 mg·kg－1的 NaHS 及30 mg·kg－1的 PPG(CSE酶抑制劑)，NaHS為H2S供體，在水溶液中解離成Na+和HS－，后者與H+結合生成H2S;發現在此劑量對急性心肌缺血損傷有較好的治療或加重作用，因此選擇上述劑量分別觀察了對其的影響。本研究還發現在給予急性心肌缺血大鼠NaHS 3 h后，心功能指標明顯改善，心肌損傷明顯減輕，且隨NaHS劑量增加心肌損傷減輕明顯;大鼠血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性也均有升高，且隨NaHS劑量增加有增高趨勢，這就提示H2S可以減輕急性心肌缺血損傷，對缺血后心臟結構和功能有一定的保護作用。Zhu等［16］也發現在心肌梗死模型中內源性H2S生成減少，給予NaHS后H2S含量增加。

與NO類似，H2S是也一種有效的血管舒張劑，最近研究證實［21－22］它是一種新型內皮舒張因子，抑制或下調其生成均會產生相反的效應。本研究也證實了這一點，在給予H2S合成酶—胱硫醚-γ-裂解酶的抑制劑PPG后，心功能受損，心肌損傷加重，血漿中H2S含量和心肌組織CSE活性也降低。

綜上所述，在大鼠急性心肌缺血H2S/CSE體系下調的情況下，給予H2S可明顯減輕心肌缺血損傷，改善心功能，從而有效保護缺血的心肌。然而心肌缺血損傷是一個多渠道、多環節的復雜病理生理過程，H2S對心肌損傷保護作用的相應機制以及臨床應用價值均有待于進一步深入探討。

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