硫化氫通過抑制p38 MAPK保護PC12細胞對抗化學性缺氧損傷

蘭愛平，梅衛義，孟金蘭，胡 芬，楊春濤，楊戰利，陳培熹，馮鑒強

長期以來，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)被認為是一種有毒的氣體。然而，隨著對H2S研究的深入，發現體內的一些組織細胞能生成H2S。它是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后，被發現的體內第3種氣體信號分子［1］。近年，不少的研究證實，H2S具有心肌保護作用［2-3］，也具有神經保護作用，例如能保護大鼠大腦皮層神經元對抗氧化應激引起的損傷［4］，對抗 β-淀粉多肽誘導 PC12 細胞損傷［5］。最近，本研究小組證實［6］，H2S能保護具有神經元形態與功能特征的PC12細胞對抗氯化鈷(cobalt chloride，CoCl2)引起的損傷。

CoCl2是一種化學性低氧模擬劑，在多種培養細胞能模擬低氧/缺血狀況，包括增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成［6-7］，降低線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)［8］等，并引起 PC12 細胞凋亡［7-9］。Zou 等［9］報道，CoCl2能增加絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族中的成員之一p38MAPK表達，p38MAPK的特異性抑制劑SB302580能抑制CoCl2誘導的PC12細胞凋亡，提示p38MAPK介導CoCl2引起的PC12細胞損傷。但是，H2S是否通過調制p38MAPK表達對抗CoCl2誘導PC12細胞損傷，迄今未見報道。本文旨在探討:(1)H2S能否抑制CoCl2對p38MAPK表達的上調作用?(2)p38MAPK抑制劑能否產生類似于H2S的神經保護作用，特別是能否抑制CoCl2引起的氧化應激反應。

1 材料與方法

1.1 材料 NaHS、CoCl2、Hochest 33258、DCFHDA、Rh123購自美國Sigma Aldrich公司，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo Lab，DMEM-F12培養基購自Gibco公司，抗p38，p-p38和Western blot檢測試劑盒SB302580(p38抑制劑)購自Cell Signaling Technoligy Inc(CST)。

這屆學術邀請展版塊的油畫藝術家更有其各自的創作風格。他們是中國國家畫院油畫院副院長郭北平；中國美術學院繪畫藝術學院院長楊參軍；北京畫院油畫創作室主任白羽平；中國寫實畫派領軍人物之一、湖北省文聯副主席冷軍；中國藝術研究院中國油畫院副院長朱春林。這5位藝術家可謂當今油畫藝術領域的實力派代表，他們以自己具有經典價值的藝術作品與學術追求，體現出他們對中國油畫藝術在新時代如何發展若干現實課題的獨特思考，提供了多方位研究油畫在當代語境下發展現狀與未來趨勢問題的經典個案。

1.2 細胞培養和預處理方法 PC12細胞由中山大學實驗動物中心提供，置于含20%新生牛血清的DMEM-F12培養基中，于37℃，5%CO2條件下培養，選取對數生長期細胞進行實驗。NaHS預處理按如下程序實施:400 μmol·L-1NaHS作用PC12細胞30 min，撤去，用 PBS洗兩次，接著給予600 μmol·L-1CoCl2作用24 h。p38抑制劑 SB302580(20 μmol·L-1)在損傷前60 min加入培養液。

北醫三院對節能的重視由來已久。醫院黨委書記金昌曉向記者介紹道，醫院在能源管理工作上，逐步完善全面的能源管理組織框架與管理制度，配套節能資金的投入，推動能源管理的平臺化發展，實現節能項目從立項到總結形成閉環管控，取得了明顯的節能成效。

1.5 Western blot法檢測p38蛋白的表達 PC12細胞接種于60 mm培養皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，用預冷的PBS洗兩次，加入細胞裂解液，4℃靜置 30 min，12 000 r·min-1離心 10 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量。總蛋白經SDSPAGE分離后，轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，隨后加入 p38、p-p38(1 ∶1 000，4℃ 過夜，用TBST洗3次，10 min/次。將PVDF膜用發光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統掃描分析結果。

2.3 H2S和p38MAPK抑制劑對抗CoCl2的致凋亡作用 Fig 3的Hochest 33258核染色法檢測結果顯示，600 μmol·L-1CoCl2處理 PC12 細胞48 h 后，使凋亡細胞數目明顯增多。在 600 μmol·L-1CoCl2處理PC12細胞前，分別應用400 μmol·L-1NaHS預處理細胞30 min或20 μmol·L-1SB302580預處理60 min均能明顯的抑制CoCl2誘導的細胞凋亡，使凋亡細胞數目減少。400 μmol·L-1NaHS 30 min或20 μmol·L-1SB302580本身不引起細胞凋亡。上述結果提示，H2S可通過抑制p38MAPK通路來對抗CoCl2的致細胞凋亡作用。

1.3 細胞存活率的檢測 PC12細胞取對數生長期細胞，以 1 ×107·L-1接種于 96 孔板，100 μl/孔。在37℃，5%CO2條件下常規培養過夜后，按實驗要求給予不同處理，每孔設8個平行孔，處理完后，每孔加入10 μl的 CCK-8，37℃繼續孵育 4 h，用酶標儀(450 nm)記錄各孔的吸光度(OD)。取4孔OD值的平均數，按公式計算細胞存活率。細胞存活率/%=處理組OD/對照組OD×100%，重復3次

本組20例患者，男8例，女13例，年齡55～65歲，平均59歲，有慢性關節疼痛或腫脹6個月以上，均經X線片或MRI檢查提示有膝關節退行性變、關節軟骨破壞的表現。排除糖尿病、血液系統疾病、免疫疾病等影響骨質的基礎疾病。

1.6 細胞內ROS含量的檢測 DCFH-DA本身沒有熒光，細胞內的ROS可將無熒光的DCFH氧化成發出綠色熒光的DCFH，綠色熒光的強弱可以間接反映細胞內ROS水平。將細胞接種于35 mm的培養皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，倒掉培養液，用無血清的低糖培養液洗兩次，隨后用10 μmol·L-1DCFH-DA染液于37℃孵育60 min。在熒光顯微鏡下隨機選取不重復的區域攝片，用Image J 1.41軟件的COLOR Hitogram模塊計算出5個視野綠色熒光強度的平均值，再對各組的樣本進行統計分析。

商品驗收。該環節控制對策主要有三項：其一，針對魚肉這一類型的食品，需要檢查商品檢疫合格證、運載工具消毒證明以及來自非疫區證明三項證明。其二，低溫庫存商品，保存溫度處于-18℃以下，需要保證其外表為凍結狀態，嚴格控制中心溫度，使其在-8℃以下。常溫以及回溫化凍食品，首先需要對其進行凍結處理，然后才可以進行入庫處理。其三，對于經過鹽水浸泡的食品、具備化學腐蝕功能的商品以及液體商品等，應該進行嚴密包裝。

1.8 統計學處理 全部實驗數據經SPSS 13.0軟件進行統計學分析，所有結果以±s表示，組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗，用LSD進行均數之間的比較。

1.7 細胞內MMP的檢測 Rh123是一種能夠被線粒體吸收的熒光染料，線粒體對其攝取能力取決于其跨膜電位。根據熒光強度可以間接反映MMP的高低，將細胞接種于35 mm的培養皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，倒掉培養液，用不含血清的低糖培養液洗兩次，隨后在含100 mg·L-1Rh123的無血清的培養基中37℃孵育45 min，在熒光顯微鏡下隨機選取不重復的區域攝片，，細胞核周圍的綠色亮點即為攝取了Rh123的線粒體。用Image J 1.41軟件的COLOR Hitogram模塊計算出5個視野綠色熒光強度的平均值，再對各組的樣本進行統計分析。

2 結果

2.2 H2S和p38MAPK抑制劑對抗CoCl2誘導的細胞毒性 Fig 2結果顯示，600 μmol·L-1CoCl2處理PC12細胞24 h后，使細胞存活率降低至(39.9±2.2)%(P＜0.01)，提示CoCl2能產生細胞毒性作用。在600 μmol·L-1CoCl2處理 PC12細胞前，分別應用400 μmol·L-1NaHS預處理細胞30 min或20 μmol·L-1SB302580(p38MAPK 抑制劑)預處理60 min均能明顯的抑制CoCl2的細胞毒性，使細胞存活率分別升高至(61.3±2.1)%和(74.3±1.7)%，與CoCl2處理組比較，均具有統計學意義(P ＜0.01)。

Fig 1 NaHS(400 μmol·L －1)preconditioning inhibited CoCl2induced activation of p38MAPK in PC12 cells#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs CoCl2

2.1 H2S阻斷CoCl2對p38MAPK表達的上調作用 本文的預實驗結果顯示，在200～800 μmol·L-1的濃度范圍內，CoCl2呈濃度依賴性的抑制PC12細胞存活率，其中600 μmol·L-1CoCl2使 PC12細胞存活率降至(39.9±2.2)%(P＜0.01)，故本文使用600 μmol·L-1作為CoCl2的損傷濃度，另一方面在12～48 h范圍內600 μmol·L-1CoCl2呈時間依賴性的抑制PCl2細胞的存活率，故本文確定24 h作為CoCl2損傷PC12細胞的時間。Fig 1結果顯示，應用 600 μmol·L-1CoCl2作用 PC12細胞 120 min，可使磷酸化(P)p38MAPK表達明顯升高，是對照組的(2.8±0.27)倍(P＜0.05)。在CoCl2處理PC12細胞前應用400 μmol·L-1NaHS預處理細胞30 min，可明顯的抑制CoCl2對p-p38MAPK表達的促進作用。

Fig 2 Effects of H2S and p38 MAPR inhibitor on inhibition of cell viability of PC12 cells by CoCl2CoCl2group:PC12 cells were treated by 600 μmol·L-1CoCl2for 24 h;NaHS+CoCl2group:PC12 cells were pretreated by 400 μmol·L-1NaHS for 30min，followed by exposure of cells to 600 μmol·L-1 CoCl2for 24h;SB302580+CoCl2group:PC12 cells were pretreated by 20 μmol·L-1SB302580(p38 MAPK inhibitor)for 60min，followed by exposure of cells to 600 μmol·L-1CoCl2for 24 h.*P ＜ 0.05 vs CoCl2;#P＜0.05 vs control

1.4 Hochest 33258核染色觀察凋亡細胞形態和數量 將PC12細胞(1×107·L-1)接種于35 mm的小號培養皿中，各實驗組按要求給予不同的處理因素后，加入新鮮配置的4%多聚甲醛(pH=7.4)于4℃固定細胞10 min，用 PBS洗兩次，加入5 mg·L-1Hochest 33258染色液染色10 min，用PBS洗兩次，加入適量的PBS后用熒光顯微鏡觀察，攝片。正常細胞核出現彌散均勻的低密度熒光;細胞核呈固縮形態或顆粒狀熒光，計為凋亡細胞。

方法1：肥皂水鑒別法。分別用兩支潔凈的試管取等量水樣，再向兩支試管中分別滴加等量肥皂水，振蕩。泡沫多、浮渣少的水樣為軟水；反之，泡沫少、浮渣多的水樣為硬水。

Fig 3 Influences of H2S and p38 MAPK inhibitor on CoCl2-induced apoptosis in PC12 cellsA-a:Control group;A-b:NaHS(400 μmol·L-1)alone had also no effect on apoptosis of PC12 cells;A-c:The inhibitor of p38 SB302580(20 μmol·L-1)itself had no effect on apoptosis of PC12 cells;A-d:CoCl2 group:exposure of cells to 600 μmol·L-1CoCl2for 48 h，significantly increased the quantities of apoptotic cells;A-e:NaHS+CoCl2group:The increased quantities of apoptotic cells induced by CoCl2were markedly decreased by NaHS pretreatment;A-f:SB302580+CoCl2group:The increased quantities of apoptotic cells induced by CoCl2were markedly decreased by SB302580(20 μmol·L-1)pretreatment.B:showing the statistical results from A.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs CoCl2

2.4 H2S和 p38MAPK抑制劑對抗 CoCl2對MMP的損傷作用 Fig 4結果顯示，600 μmol·L-1CoCl2處理PC12細胞24 h后，使細胞內的平均熒光強度(MFI，為 MMP大小的指標)從55.2±2.7(對照組)降到31.5±2.2(P＜0.01)，提示CoCl2能損傷線粒體，使 MMP降低。然而，在600 μmol·L-1CoCl2處理PC12細胞前，分別應用400 μmol·L-1NaHS預處理細胞30 min或20 μmol·L-1SB302580預處理60 min均能阻斷CoCl2降低MMP的作用，MFI分別升高至41.5±2.1(P＜0.05)和46.2±2.3(P ＜0.01)。

Fig 4 Effects of H2S and p38 MAPK inhibitor on the loss of MMP induced by CoCl2in PC12 cells(n=3)MMP of PC12 cells was detected by using the fluorescent dye Rh123.##P＜0.01 vs control;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CoCl2

Fig 5 Effects of H2S and p38 MAPK inhibitor on CoCl2-induced intracellular ROS generation in PC12 cells(n=3)ROS of PC12 cells was detected by using the fluorescent dye DCFHDA.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs CoCl2

2.5 H2S和p38MAPK抑制劑抑制CoCl2引起的ROS過度生成 Fig 5結果顯示，600 μmol·L-1CoCl2處理PC12細胞6 h后，使細胞內ROS水平比正常對照組高1.8倍(MFI為56.1±1.4)(P＜0.05)。在600 μmol·L-1CoCl2處理PC12 細胞前，分別應用400 μmol·L-1NaHS預處理細胞30 min或 20 μmol·L-1SB302580 預處理 60 min，均能抑制CoCl2促進 ROS生成作用，分別使 MFI降低至43.5±2.2(P＜0.05)和39.3±1.4(P＜0.05)。400 μmol·L-1NaHS 或 20 μmol·L-1SB302580 本身對細胞內ROS水平無明顯影響。

3 討論

本文再次證實化學性低氧模擬劑CoCl2能誘導類似于缺氧/缺血性損傷，使PC12細胞存活率降低，凋亡細胞數量增多，MMP丟失及ROS生成增多，這與前文［6-9］的報道一致，另一方面，本文觀察到CoCl2能促進p38MAPK表達，p38MAPK抑制劑SB302580不僅能減弱CoCl2的細胞毒性，而且能抑制它的致凋亡作用，提示p38MAPK可能介導CoCl2引起的細胞毒性及致凋亡作用。在 PC12細胞，p38MAPK被認為是多種傷害性刺激引起細胞凋亡的信號分子之一［10］。p38MAPK也與低氧引起的成骨細胞的凋亡成正相關關系［11］。有趣的是，我們發現p38MAPK抑制劑能改善線粒體的功能，使CoCl2引起的MMP丟失減少，并抑制胞內ROS過度生成，提示CoCl2損傷PC12細胞的機制之一是通過上調p38MAPK進而促進胞內氧化應激反應，使ROS生成增多，MMP丟失。Zou等［9］也觀察到 p38MAPK可通過激活caspase-3介導CoCl2誘導PC12細胞凋亡。由此可以看出，CoCl2誘導類似缺氧缺血反應的機制是比較復雜的。

重要的是，本研究證實H2S在保護PC12細胞對抗化學性缺氧損傷的同時，能明顯的抑制CoCl2對p38MAPK表達的上調作用，提示通過抑制p38MAPK表達是H2S的神經保護機制之一。在人的粒細胞，H2S可通過抑制p38MAPK和caspase-3來提高細胞存活率［12］。在小膠質細胞的實驗模型，H2S可通過抑制p38MAPK表達來對抗脂多糖引起的炎癥反應［13］。這些研究均支持本文的實驗結果。

綜上所述，本文在PC12細胞，首次證實H2S通過抑制p38MAPK信號通路來對抗化學性缺氧引起的神經損傷作用，使細胞存活率升高，細胞凋亡數量降低，MMP丟失及ROS生成均減少，這為深入闡明H2S的神經保護機制提供了新的實驗資料，為防治缺血缺氧性神經損傷提供了新的治療靶點。

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