染料木素促成骨樣細胞增殖作用及其機制研究

牛銀波，李宇華，黃海濤，孔祥鶴，王婷梅，梅其炳，

目前，在骨質疏松防治研究領域，通過刺激骨形成防治骨質疏松已成為研究的熱點［1］。染料木素是大豆異黃酮的主要成份，研究表明［2］染料木素具有抗骨質疏松的作用，它在抑制骨吸收的同時還可以促進骨形成。

研究表明［3-4］，在骨形成過程中骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)及 Wnt/βcatenin信號通路發揮著極其重要的調控作用。BMP-2可促進骨形成和成骨細胞分化［5］。Wnt/βcatenin信號通路中的關鍵核心分子β-catenin在胞質中積聚轉入核內時，可促進體外成骨細胞發育及體內的骨形成［6］。因此，本研究通過不同濃度染料木素對成骨樣細胞增殖作用的影響及對BMP-2和β-catenin表達的影響，初步探討染料木素防治骨質疏松癥的機制。

1 材料

1.1 藥物和試劑 染料木素(純度為98%)購于西安斯諾特生物技術有限公司，雌激素(β-estradiol，E2，純度為98%)購于 Sigma公司，小鼠MC3T3-E1成骨樣細胞株購自中國科學院上海生化細胞所細胞庫，DMEM培養基(Gibco公司)，胎牛血清(四季青生物制劑公司)，胰蛋白酶、EDTA、二甲基亞砜(DMSO)，MTT(均購于 Sigma公司)，ALP試劑盒(南京建成生物公司)，BMP-2(Bio worlde公司)，β-catenin及 β-actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 實驗分組 實驗分為對照組(Control組)，雌激素組(E2，1 ×10-9mol·L-1的雌激素)，染料木素各組(1 ×10-10、1 ×10-9、1 ×10-8、1 ×10-7、1 ×10-6和1×10-5mol·L-1)，分別按濃度配制成相應含藥培養液備用。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞增殖率 取生長良好、處于對數增生期的MC3T3-E1細胞以5×106·L-1的密度接種于96孔板內，置于37℃、5%CO2培養箱中培養12 h，使細胞充分貼壁。隨機分組處理，分別加入含1×10-9mol·L-1雌激素和不同濃度染料木素(1 ×10-10、1 ×10-9、1 ×10-8、1 ×10-7、1 ×10-6和 1×10-5mol·L-1)的培養液 200 μl，對照組僅加入200 μl的含0.54‰ DMSO的培養液，同時設置空白組用于調零，空白組未接種細胞，僅加入200 μl的DMEM培養液，每組設5個平行孔。將96孔板置于培養箱繼續培養24、48和72 h。取出培養板，每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μl，再繼續孵育4 h后，終止培養。棄去存留的孵育液，每孔加入150 μl的DMSO，于微量振蕩儀上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀上檢測各孔570 nm波長的吸光度。計算細胞增殖率:

2.2 堿性磷酸酶(ALP)活性測定 24孔板每孔接種1×108·L-1細胞，細胞貼壁后換含1×10-9mol·L-1雌激素和不同濃度染料木素(1×10-10、1×10-9、1 ×10-8、1 × 10-7、1 × 10-6和 1 × 10-5mol·L-1)的培養液。加藥24和48 h后，按照堿性磷酸酶測定試劑盒說明進行操作，采用DU800型紫外分光光度計測定各組520 nm處吸光度，計算ALP活力單位，同時測定每個樣品的蛋白含量，結果用U·mg-1Pro表示。

2.3 Western blot測定 BMP-2 和 β-catenin 的表達 將對照組和染料木素各組(1×10-9、1×10-8和1×10-7mol·L-1)的細胞用細胞刮收集后加入RIPA(含PMSF蛋白酶抑制劑)細胞裂解液提取總蛋白，用Bio-Rad酶標儀進行蛋白定量。蛋白變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜。NC膜用5%脫脂牛奶室溫封閉3 h，依次加兔抗BMP-2(1∶500)、βcatenin(1∶200)及鼠抗β-actin(1∶500)一抗室溫孵育30 min后4℃過夜，TBST洗膜后加1∶5 000稀釋的相應HRP標記二抗，室溫孵育1 h，TBST及TBS洗膜后，進行化學發光。發光條帶進行灰度分析以觀察各蛋白表達水平的變化。

2.4 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件中的方差分析(ANOVA)進行數據統計。

3 結果

3.1 MTT細胞增殖試驗檢測染料木素的促細胞增殖效應 MC3T3-E1細胞經雌激素和不同濃度染料木素處理后，MTT法測各組A值。實驗結果顯示，與對照組相比，1×10-8、1×10-7、1 ×10-6和 1×10-5mol·L-1的染料木素作用于細胞24 h后均能促進成骨樣細胞增殖(P＜0.05或P＜0.01)，染料木素作用于細胞48和72 h后，各濃度染料木素(1×10-10、1 ×10-9、1 ×10-8、1 ×10-7、1 ×10-6和 1 ×10-5mol·L-1)均能促進成骨樣細胞增殖(P＜0.05或 P ＜0.01)，見Fig 1。

3.2 不同濃度的染料木素對成骨樣細胞ALP活性的影響 染料木素作用于細胞24和48 h后，1×10-10mol·L-1濃度組與對照組相比ALP含量無明顯變化(P＞0.05)，但隨著濃度的升高，染料木素組ALP含量水平均升高，1×10-9、1×10-6和1×10-5mol·L-1濃度組與對照組相比差異有統計學意義(P ＜0.05);1×10-8、1 ×10-7mol·L-1濃度組與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)，見Fig 2。

3.3 染料木素對 MC3T3-E1細胞 BMP-2和 βcatenin蛋白表達的影響 不同濃度染料木素(1×10-9、1 ×10-8和1 ×10-7mol·L-1)培養 MC3T3-E1細胞48 h后，通過Western blot檢測MC3T3-E1細胞BMP-2和β-catenin蛋白的表達。結果表明，染料木素可使細胞中BMP-2和β-catenin表達水平升高，且呈濃度依賴性變化，見Fig 3。

Fig 1 Effect of genistein on the proliferation of MC3T3-E1 cells(n=5)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Fig 2 Effect of genistein on the ALP of MC3T3-E1 cells(n=3)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

4 討論

雌激素雖然能有效地防止老年或絕經婦女的骨丟失，保持骨量，減少骨折發生，但同時也增加了用藥者乳腺癌和子宮內膜癌等的患病風險［7］。因此，尋找天然物質進行替代治療，降低治療帶來的副作用十分必要。染料木素是豆類及其制品中含量較多的一種植物雌激素，其結構與雌激素相似，同時它具有抗骨質疏松的作用，在抑制骨吸收的同時還可以促進骨形成［8］。

成骨細胞是間質起源的單個核細胞，是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質的合成、分泌和礦化［9］。ALP是成骨細胞分化時所分泌的酶，是其分化和功能的標志，ALP的活性反映了成骨細胞的成骨活性［10］。本實驗結果表明，不同濃度染料木素作用于成骨樣細胞MC3T3-E1后可促進成骨樣細胞增殖和分化，其促成骨細胞增殖分化作用雖弱于雌激素，但對子宮的副作用明顯弱于雌激素［7，11］。BMPs可誘導骨髓基質干細胞分化為成骨細胞，現已證明，BMPs參與調節細胞的增殖、分化和凋亡，在成骨細胞的分化過程中發揮的作用尤為重要［12］。大量臨床前及臨床研究表明重組的BMPs可以促進動物和人的骨組織再生。目前，BMP-2已經獲準臨床使用。本實驗結果顯示染料木素可促進BMP-2表達。Wnt/β-catenin信號通路在骨形成和骨代謝過程中發揮著極其重要的調控作用，其通路中的關鍵分子GSK3β的底物 β-catenin在胞質中積聚并穿梭進入核內時，可刺激Wnt信號下游一系列靶基因的轉錄，從而發揮調控細胞生長，促進體外成骨細胞發育及體內的骨形成［13-14］。染料木素可以上調β-catenin的表達。表明染料木素可同時通過BMP-2和Wnt/β-catenin信號通路促進成骨樣細胞增殖與分化。

Fig 3 Effect of genistein on protein level of β-catenin and BMP-2 in MC3T3-E1 cells(n=3)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

綜上所述，染料木素具有促成骨樣細胞增殖、分化的作用，其與 BMP-2和 Wnt/β-catenin信號通路的激活密切相關。這將為染料木素開發成新型抗骨質疏松藥物提供實驗依據。

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