孕酮對嗎啡條件性位置偏愛大鼠相關腦區中樞多巴胺D2受體水平的影響

于動震，侯艷寧

單胺類神經遞質同樣是與阿片類物質依賴有密切關系的一種重要的神經遞質，包括兒茶酚胺和吲哚胺等，前者主要指去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、腎上腺素(epinephrine，E)和多巴胺(dopamine，DA)，后者主要指 5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine，5-HT)。單胺類神經遞質在中樞神經系統中參與腦缺血、鎮痛以及學習記憶等多種病理生理過程。另外，該類神經活性物質在嗎啡依賴的形成和復吸過程中也具有重要的作用，而且DA是動機活動和產生欣快感的重要神經遞質，對情緒、學習記憶和運動等的調節至關重要［1］。DA發揮上述生理作用，必須通過與其受體結合才能實現。多巴胺受體屬于G蛋白偶聯受體，都是由大約400個氨基酸構成，分子質量在50 000 u左右。氨基酸鏈在細胞外為N-末端，細胞內為C-末端，所有亞型受體都穿透膜。根據細胞內信號轉導過程的差異，即其結構特性及其對腺苷酸環化酶(adenylate cyclase，AC)的不同調節作用，主要分為DⅠ型和DⅡ型兩類受體。DⅠ型受體包括D1和D5受體，DⅡ型受體包括D3、D4和D5受體。D1受體參與嗎啡引起的運動增強效應，其拮抗劑可以減少嗎啡成癮大鼠對環境刺激的反應，即降低了該大鼠感受欣快的效應，增加了大鼠覓藥動機，又抑制了該大鼠的行為活動［2］。在藥物依賴的作用中，與D1受體相比，D2受體的作用似乎更加突出。行為實驗證明，D2受體激動劑可產生精神興奮劑樣的行為效應，增強運動性活動、定型行為及其他強化反應，并降低伏隔核內腦啡肽前體mRNA的生成量［3］。D2拮抗劑明顯阻滯動物自身給藥的獎賞效應和減弱條件性位置偏愛［4－5］。中腦邊緣多巴胺系統(meolimbic dopamine system，MLDS)是公認的與成癮有關的重要腦區［6］，在藥物的反復作用下MLDS內相關核團或神經元突觸發生持續的對抗性適應，特別是DA受體會發生一系列適應性變化，涉及到受體的數量或活性、細胞內信號轉導分子活性或信號轉導途徑，以及進一步的基因表達等的改變，這些適應性變化構成了藥物依賴的神經生物化學基礎［6－7］。有研究表明，伏隔核內多巴胺神經元直接參與阿片的急性獎賞效應及負性強化作用［8］。

目前，關于嗎啡精神依賴對腦內神經甾體水平影響報道較多，而對外源性神經甾體影響嗎啡精神依賴及其機制研究的相關報道較少。本實驗室前期研究表明［9－11］，孕酮可以有效的抑制大鼠嗎啡條件性位置偏愛的獲得，并且中樞單胺類神經遞質水平的變化在孕酮逆轉嗎啡CPP過程中發揮了重要的作用，但是DA受體在孕酮逆轉大鼠嗎啡位置偏愛時是否發生了變化在國內外尚未見報道，為了解決這一問題，本實驗采用了免疫組織化學(immunohistochemistry)方法，研究了嗎啡CPP時，大鼠伏隔核(nucleus accumbens，NA)、腹側被蓋區(ventral tegmental area，VTA)及紋狀體(striatum，ST)內 D2 受體水平的變化，最終探討了單獨使用孕酮訓練或與嗎啡合用時，對大鼠伏隔核、腹側被蓋區及紋狀體內D2受體水平的影響，進一步深入探討神經甾體孕酮抑制嗎啡CPP效應的中樞單胺受體機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 ♂ Sprague Dawley(SD)大鼠32只，實驗開始時體質量170～180 g，河北省實驗動物中心提供(清潔 Ⅱ級，合格證號:603216)。將大鼠隨機分為4組，分別為空白對照(C)組、嗎啡(Mor)組、孕酮(PROG)組和孕酮加嗎啡(PROG+Mor)組，每組動物8只。動物適應新環境5 d后再進行實驗，水和食物自由獲得。

1.2 藥品和試劑 孕酮購自美國Sigma公司，溶于10%的2-羥丙基-β-環糊精中，配成濃度為5 g·L－1的孕酮溶液;鹽酸嗎啡注射液購自沈陽第一制藥廠，溶于生理鹽水中，配成濃度為2.5 g·L－1的溶液;兔抗鼠多巴胺 D2受體，購于 Chemicon公司。二抗SP-9001系列工作液試劑盒(包括A:內源性過氧化酶阻斷劑，B:封閉用正常山羊血清，C:生物素標記羊抗兔IgG，D:辣根酶標記鏈酶卵白素工作液)及抗體稀釋液購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 主要儀器 Dig Behv動物行為分析系統和位置偏愛視頻分析系統(上海吉量軟件科技有限公司);A0392脫水機、HISTOECENTR包埋機、AS325R切片機(英國Thermo公司);PHY-Ⅱ病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器廠);YWY781B醫用微波儀(浙江臨安電子器材廠);DH64電熱恒溫干燥箱(上海市躍進醫療器械一廠)。

1.4 實驗方法

1.4.1 CPP的建立 參考文獻方法［4］略做修改。訓練前先分析大鼠在訓練箱的黑室和白室的累積停留時間，測定大鼠的自然位置偏愛，在本實驗條件下為黑室。以非位置偏愛側即訓練箱的白室為伴藥側，訓練時用隔板封閉黑白兩室的通道，大鼠每天訓練2次，上午(8:00)注射后放入白室，下午(14:00)注射后放入黑室，大鼠每次在箱內均停留45 min，兩次間隔6 h。Mor和PROG+Mor組大鼠上午腹腔注射嗎啡5 mg·kg－1，給予嗎啡的前10 min分別給予皮下注射10%的2-羥丙基-β-環糊精和PROG均為15 mg·kg－1，下午均注射等量的生理鹽水和10%的2-羥丙基-β-環糊精，連續訓練10 d。最后1次訓練后24 h進行CPP測試，測試時將隔板倒置，使大鼠可以在黑白箱中自由出入，記錄在不給藥狀態下10 min內大鼠的活動情況，并軟件分析大鼠在白室的累積停留時間。

1.4.2 樣品的處理 CPP測試結束后，將SD大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉(2%，W/V，0.3 ml/100 g體質量)，開胸，以30℃的生理鹽水(50～100 ml/250～350 g)經左心室灌流，然后以4%多聚甲醛200 ml灌流固定，總時間大于30 min。開顱，取出整個大腦，去除小腦，置4%多聚甲醛60 ml于4℃后固定，石蠟包埋，進行連續冠狀切片，切片厚3 μm，隔二取一，每只大鼠每個腦區做6套切片，置干燥箱烘干備用。

1.4.3 D2受體ABC法免疫細胞化學染色 取出標本，過氧化氫室溫孵育5 min;正常羊血清封閉非特異性抗原;傾去血清，滴加一抗工作液(1∶100稀釋)室溫濕盒中放置1 h后置4℃冰箱過夜;滴加生物素標記的二抗工作液，室溫濕盒中放置75 min;滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液;DAB顯色，蘇木精復染10 min，自來水沖洗;體積分數為1%鹽酸乙醇分色;1%氨水中和;常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 統計學分析 采用Image-Pro Plus 5.1分析軟件測定D2受體表達的平均光密度(MOD)，結果以±s表示，每張片子隨機選5個視野，取均值作為此樣本的MOD值，數據采用SPSS 17.0軟件，各組間采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，繼于LSD檢驗。

2 結果

2.1 孕酮對嗎啡CPP效應獲得的影響 5 mg·kg－1嗎啡訓練10 d后，嗎啡組在伴藥側的停留時間明顯長于本組訓練前及空白對照組，分別延長了40.24%和36.99%(P＜0.01)。單獨給予15 mg·kg－1孕酮訓練10 d，大鼠在伴藥側的停留時間與本組訓練前及空白對照組比較差異均無顯著性(P＞0.05)。在給予嗎啡的前10 min給予15 mg·kg－1孕酮，大鼠在伴藥側的停留時間與訓練前及空白對照組比較差異均無顯著性(P＞0.05)，與嗎啡組比較縮短22.78%(P＜0.01)。結果見Tab 1。

2.2 D2受體在正常♂大鼠部分腦區內的分布 在空白對照組大鼠各個腦區中，可以發現D2受體在腹側被蓋區、紋狀體和伏隔核中均有表達，但以紋狀體和伏隔核中的表達密度較高，而腹側被蓋區的表達密度較低，僅為紋狀體中的56.58%，結果見Tab 2，Fig 1 ～3。

2.3 外源性嗎啡慢性處理對大鼠腦區中D2受體表達的影響 與空白對照組相比，5 mg·kg－1嗎啡訓練10d后，Mor組大鼠腹側被蓋區、紋狀體和伏隔核中D2受體水平降低(均為P＜0.01)，分別減少了37%、20%和27%。結果見Tab 2，Fig 1～3。

Fig 1 Immunohistochemical staining of D2 receptor in ventral tegmental area of rats brain(×400)A:Blank control group;B:Morphine group;C:PROG group;D:PROG+morphine group

Fig 2 Immunohistochemical staining of D2 receptor in striatum of rats brain(×400)A:Blank control group;B:Morphine group;C:PROG group;D:PROG+morphine group

Fig 3 Immunohistochemical staining of D2 receptor in nucleus accumbens of rats brain(×400)A:Blank control group;B:Morphine group;C:PROG group;D:PROG+morphine group

Tab 1 Effects of progesterone on time that the rats spent in the drug-paired chamber of the test apparatus(T/s，±s，n=8)

Tab 1 Effects of progesterone on time that the rats spent in the drug-paired chamber of the test apparatus(T/s，±s，n=8)

C:Trained with 15 mg·kg－1cyclodextrin plus 5 mg·kg－1saline;Mor:Trained with 15 mg·kg－1cyclodextrin plus 5 mg·kg－1morphine;PROG:Trained with 15 mg·kg－1progesterone plus 5 mg·kg－1saline;PROG+Mor:Trained with 15 mg·kg－1progesterone plus 5 mg·kg－1 morphine.BT:Before training，AT:After training.＊＊P ＜0.01 vs C;##P＜0.01 vs BT;△△P＜0.01 vs Mor

C Mor PROG PROG+Mor BT 171±36 169.0±45 172±48 175.0±53 AT 173±41 237.0±51＊＊##177 ±60 183.0±56△△

2.4 單獨給予外源性神經甾體孕酮對大鼠腦區中D2受體表達的影響 與空白對照組比較，單獨給予15 mg·kg－1孕酮訓練10 d，D2受體的數量在各個腦區中未有變化(P＞0.05)。

Tab 2 Effect of PROG on the MOD of D2 receptor in hippocampus and striatum of rats brain( ± s，n=8)

Tab 2 Effect of PROG on the MOD of D2 receptor in hippocampus and striatum of rats brain( ± s，n=8)

VTA:Ventral tegmental area;ST:Striatum;NA:Nucleus accumbens;＊＊P＜0.01 vs C;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Mor

VTA ST NA C 51.95 ±5.20 91.82 ±6.19 84.45 ±6.29 Mor 32.33 ±7.61＊＊ 73.41 ±3.26＊＊ 61.98 ±3.54＊＊PROG 54.74 ±6.18 88.38 ±7.19 86.76 ±5.72 P+Mor 30.13 ±6.58 86.62 ±4.52△ 85.37 ±4.46△△

2.5 孕酮對嗎啡CPP大鼠相關腦區中D2受體表達的影響 與嗎啡組比較，在給予嗎啡的前10 min給予15 mg·kg－1孕酮進行條件性訓練10 d后，大鼠紋狀體和伏隔核中D2受體水平升高(P＜0.05和P＜0.01)，但腹側被蓋區中還是保持較低的水平(P ＞0.05)，結果見 Tab 2，Fig 1～3。

3 討論

阿片類物質的精神依賴是指用藥才能達到心理滿足，驅使其覓藥和濫用。關于精神依賴的發生機制，以Wise和Bozart為代表的“精神刺激”學說認為，追求阿片類藥物帶來的欣快感和獎賞效應(正性強化作用)是引起依賴形成的始動因素。藥物的正性強化效應主要涉及3個大腦系統，即:中腦邊緣多巴胺系統、內源性阿片肽系統和β-氨基丁酸/谷氨酸能神經系統。本實驗采用免疫組化技術，根據本實驗室前期的工作基礎，有選擇性的測定了與阿片類獎賞回路相關的部分腦區中D2受體的表達。在實驗進行過程中，我們根據Chemicon公司所提供的資料，在抗體效價的1∶200～1∶500區間中，采用了1∶200、1∶300、1∶400和1 ∶500分別進行預實驗，結果均不是十分理想，最后抗體的效價到1∶100時，發現免疫反應性最強。從Tab 2中可以發現，在空白對照組動物的不同腦區中，D2受體在紋狀體、伏隔核、腹側被蓋區等處都有分布，但存在著很大的差別，其中以紋狀體和伏隔核中的密度較高，這與以往的研究報道結果相一致［12］。

研究表明，嗎啡產生精神依賴的神經解剖基礎是伏隔核、腹側被蓋區、額葉皮質、海馬和杏仁核等，即所謂的獎賞回路。神經生化研究表明［13］，嗎啡覓藥行為的形成涉及氨基酸、單胺、類阿片肽等多種神經遞質。其中腹側被蓋區－伏隔核是一條DA能通路，阿片類藥物通過與腹側被蓋區神經元上的阿片μ受體結合，降低GABA能神經元活性，減少GABA的釋放，從而取消了對DA能神經元的緊張性抑制，導致伏隔核內DA釋放增加，被公認為是嗎啡產生獎賞效應的主要神經生物學基礎［13］。但也有研究認為［14－15］，促進紋狀體內 DA 釋放增加，亦是大多數成癮類藥物的一個共同特征，阻斷腹側紋狀體的DA釋放可以降低成癮藥物的大部分作用，比如條件性位置偏好。本研究發現，嗎啡CPP形成時，腹側被蓋區、伏隔核和紋狀體內D2的表達均明顯減少，分別減少37%、20%和27%，均有統計學意義，這提示在嗎啡所致的CPP發生的病理過程中，中樞神經系統內D2受體發生了適應性變化，此變化可能參與了嗎啡CPP的形成，腹側被蓋區、伏隔核及紋狀體內D2受體水平的變化對嗎啡覓藥行為具有重要的意義。

以往的許多研究證據表明，D1和D2受體在藥物依賴中有相似的作用，兩種受體都參與藥物的運動效應和行為敏感化，D1和D2受體的拮抗劑都能阻斷嗎啡導致的活動增強，所以D1和D2受體可能在藥物的強化、獎賞、活動增強、行為敏感化等方面都有重要的作用。但是，它們可能通過各自不同分受體后傳導途徑，參與到強化等的調節過程，D1受體可能參加與感覺成分有關的強化反應，而D2受體可能更多的與成癮過程中的覓藥行為有關［16－17］。伏隔核的殼部屬于邊緣系統，是參與多種成癮性藥物獎賞效應的部分，該部位盡管接受杏仁核、額葉皮質、海馬、顳葉皮層及大部分丘腦核團的傳入投入，但主要接受來自于中腦腹側被蓋區的DA能投射［18］，大量的研究發現中腦被蓋區－伏隔核－額葉皮質是成癮性藥物獎賞效應的最后公共通路［19］，在我們的實驗中，在給予嗎啡的前10 min給予15 mg·kg－1孕酮進行條件性訓練10 d后，在行為學上表現為大鼠嗎啡精神依賴得到了有效控制［9－11］，神經生化上表現為伏隔核和中腦腹側被蓋區內DA水平明顯降低［14］，分子生物學水平上表現為大鼠紋狀體和伏隔核中D2受體水平明顯升高18%和39%，該結果提示，外源性神經甾體孕酮可以通過改變嗎啡精神依賴時明顯降低的D2受體水平，進而影響中樞單胺類神經遞質的合成和釋放，這一過程是孕酮對大鼠嗎啡CPP實現逆轉的有效途徑之一。所以，根據我們的實驗結果可以推測，孕酮與嗎啡合用時可能直接解除了嗎啡對伏隔核區DA轉運子的抑制效應，D2受體水平升高使細胞外DA濃度降低，從而產生逆轉大鼠CPP的效應。與嗎啡組相比，孕酮+嗎啡組大鼠盡管在中腦腹側被蓋區中D2受體水平未見明顯升高，但受體的活性是否發生了改變，是值得進一步深入研究的問題。

綜上所述，本實驗表明大鼠嗎啡條件性位置偏愛形成時，腹側被蓋區、紋狀體和伏隔核中D2受體表達水平下降;孕酮伴隨給藥時可以逆轉大鼠條件性位置偏愛的形成，紋狀體和伏隔核中D2受體表達水平的改變可能參與了上述逆轉過程。

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