實驗性變態反應性腦脊髓炎豚鼠外周血單個核細胞分泌IL-4量的研究

瀘州醫學院附屬醫院神經內科(瀘州 646000)

呂志宇 李曉紅 榮本兵 李作孝*

多發性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一種以中樞神經系統白質脫髓鞘為主要病理特點的自身免疫性疾病。實驗性變態反應性腦脊髓炎模型(Experimental allergic encephalomyelitis,EAE)與MS具有很多共同的特征,是國際公認的MS動物模型[1]。研究認為MS和EAE是由Th1介導的自身免疫性疾病,與Th1/Th2比例失衡有關[2]。本研究通過觀察EAE豚鼠發病的臨床癥狀、PBMC分泌 IL-4的量及兩者的相關性,探討Th2型細胞因子 IL-4在 EAE發病中的作用。

材料和方法

1 實驗動物 雌性健康豚鼠 30只,體重250～300g;健康 SD大鼠 5只,體重200～250g。以上兩種動物均由瀘州醫學院實驗動物科提供,都屬于一級合格動物。

2 藥物及主要試劑 IL-4 ELISA試劑盒,為晶美公司產品;淋巴細胞分離液(比重1.077±0.002g/ml,)為上海君創生物科技有限公司產品;弗氏完全佐劑(含卡介苗 10mg/ml),為sigma公司產品。

3 方 法

3.1 免疫抗原制備:將大鼠處死后,迅速取出脊髓,用勻漿器制成50%(重量 /體積)的脊髓冰生理鹽水勻漿,后與等量的弗氏完全佐劑(卡介苗 10mg/ml)混合,用注射器抽打至油包水乳劑,制成粗制髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein,MBP)。用粗制 MBP抗原注入豚鼠后足掌皮下,每側 0.3ml制造 EAE模型。

3.2 實驗分組、動物模型制備:將30只雌性豚鼠隨機分為3組并進行編號:分別為正常對照組、EAE模型組及佐劑對照組,每組均為10只。

3.3 EAE豚鼠發病情況記錄及神經功能障礙評分:豚鼠致敏后,每天同一時間(10∶00AM)對實驗豚鼠進行稱重并對各 EAE組豚鼠發病情況進行記錄以及神經功能障礙評分。神經功能障礙評分標準:0分:無明顯異常;1分:后肢不全癱瘓;2分:后肢完全癱瘓;3分:后肢全癱伴前肢不全癱;4分:四肢全癱或死亡。癥狀介于兩條標準之間者以±0.5分計。

3.4 實驗終止:將四肢癱瘓、死亡或連續3d癥狀評分無加重時作為發病的高峰期,在發病高峰期處死動物;未發病的動物觀察4周后處死;正常對照組 4周后處死。

3.5 PBMC培養上清液 IL-4水平測定:取肝素抗凝的眶靜脈血用 Hanks液稀釋一倍,將其輕鋪在葡聚糖泛影蒲胺(Ficll-Urografin)分層液(比重1.077)上,然后用水平離心機離心單個核細胞懸于分層液上層。用毛吸吸管吸取單個核細胞層,加入Hanks液清洗、離心。加入含5%的小牛血清RPMI-1640培養基制成細胞懸液(細胞計數 2×105)。經檢測活細胞比例均＞95%。取1ml調配完畢的細胞懸液放入培養皿中,加入ConA(終含量為10μg/ml)放置于37℃,5%CO2培養箱中孵育4h以激活單個核細胞,收集上清液,-20℃保存。收集保存的上清液標本于半月內解凍,離心除去沉淀物。ELISA法檢測 IL-4含量,檢測按說明書方法進行。

結 果

1 臨床癥狀:正常對照組及佐劑對照組均未發病,EAE模型組所有豚鼠均有發病,潛伏期為11.8±2.4d,進展期為7.4±2.1d,高峰期神經功能障礙評分為3.4±0.7分?；疾‰嗍蟊憩F為皮毛脫落、體重下降、肢體無力、自傷后肢,重者四肢癱瘓、抽搐、死亡。

2 各組豚鼠 PBMC分泌 IL-4的水平,見表1。EAE模型組豚鼠發病高峰期 PBMC分泌 IL-4的量較正常對照組顯著升高(P＜0.01);而佐劑對照組PBMC分泌 IL-4的量與正常對照組差異無統計學意義。

表1 各組豚鼠 PBMC分泌 IL-4水平(±s)

表1 各組豚鼠 PBMC分泌 IL-4水平(±s)

注:與正常對照組比較,* P ＜0.01,△＞0.05;與EAE模型組比較,# P ＜0.01

EAE模型組 10 14.04±3.17*佐劑對照組 10 20.41±3.16△#F值 16.48 P值 ＜0.01

3 EAE模型組豚鼠 PBMC分泌 IL-4的量與發病潛伏期、進展期、神經功能障礙評分相關性分析,見表2。EAE模型組豚鼠 PBMC分泌IL-4的量與豚鼠發病潛伏期呈正相關(P＜0.05),而與發病進展期及高峰期神經功能障礙評分呈負相關(P＜0.05)。

表2 IL-4的水平與潛伏期、進展期、神經功能障礙評分相關性分析

討 論

EAE動物模型建立的關鍵因素是致敏抗原和敏感品系動物的選擇,本實驗采用易致敏且在國內易獲得的豚鼠作為致敏動物,用粗制 MBP作為抗原誘發EAE[3]。EAE模型在接種平均 12d后出現厭食、體重下降,不同程度的肢體癱瘓,且均表現為單病程發病。組織病理學變化主要為CNS白質內小血管周圍有大量炎性細胞浸潤。與經典的EAE表現吻合,證明造模成功。

根據CD4+T細胞所產生細胞因子的種類,可將其分為Thl和Th2細胞。兩類細胞所分泌的細胞因子譜及其生物學功能均有所不同,Thl細胞主要參與細胞免疫,介導與細胞毒和遲發型超敏性反應有關的應答,故 Thl細胞亦稱為遲發型超敏性性 T細胞(TDTH細胞);Th2細胞主要功能是增強 B細胞介導的體液免疫應答。Thl細胞主要分泌 IFN-α,IL-2、IL-12和TNF-α等促炎性細胞因子,Th2細胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等抗炎性細胞因子。Thl和Th2細胞可通過各自分泌的細胞因子彼此抑制。正常情況下,Thl和Th2細胞及其分泌的細胞因子處于動態平衡中,并受到機體的嚴格調控[4]。近年發現,如果Th 1/Th2平衡發生偏離可導致一些自身免疫性疾病的發生[5,6]。

IL-4作為Th2細胞因子,能下調 Th1型細胞活性,抑制 Th1型細胞因子如 IFN-γ的作用。給 NOD小鼠投以 IL-4可防止或延緩小鼠產生 Th1細胞介導的自身免疫病型糖尿病,產生口服耐受和EAE恢復期的動物IL-4表達增強。因此IL-4可作為免疫調節因子抑制遲發型超敏反應,治療EAE[7]。呂雪瑩[8]等人認為在疾病的急性期免疫抑制因子 IL-4濃度低于正常水平,不能抑制 IFN-γ的促發和促進的CNS自身免疫反應及致炎性脫髓鞘作用。而 IL-4可能在恢復期起作用,通過其產生細胞Th2抑制Th1細胞的活化及炎性細胞因子的分泌,從而促使 EAE恢復。本實驗通過對EAE豚鼠 PBMC培養上清液中具代表性的Th2類細胞因子 IL-4的檢測,結果發現在發病高峰期,EAE模型組PBMC分泌 IL-4的量比正常對照組顯著降低(P＜0.01),這說明 EAE豚鼠體內存在著免疫失衡,IL-4在EAE的發病中扮演重要的角色。

本實驗的Person相關分析顯示 EAE豚鼠 PBMC分泌的IL-4量與豚鼠發病的潛伏期呈正相關,與發病的進展期及神經功能障礙評分呈負相關(P＜0.05)。說明EAE豚鼠發病的嚴重程度與IL-4含量有相關性。

綜上所述,EAE豚鼠體內存在免疫失衡,IL-4分泌量降低,且與發病的嚴重程度有相關性。檢測MS患者血清 IL-4含量對判斷疾病的活動性及嚴重程度有重要價值,可能對指導 MS的新藥療效有重要的臨床價值。

[1] Render MP.The pathophysiology of acute experimental allergic encephalomyelitis in the rabbit[J].Brain,1994,107:699.

[2] Nakajima H,Fukuda K,Doi Y,etal.Expression of TH1/TH2-related chemokine receptors on peripheral T cells and correlation with clinical disease activity in patients with multiple sclerosis[J].Eur Neurol,2004,52(3):162-8.

[3] 榮本兵,李作孝.全脊髓勻漿建立豚鼠實驗性自身免疫性腦脊炎模型[J].瀘州醫學院學報,2007,30(2):104-106.

[4] 趙武述.免疫平衡研究及其臨床意義[M].北京:科學出版社,2005:100-101.

[5] Kidd P.Thl/Th2 Balance: The hypothesis,its limitations,and Implications for health and disease[J].Altern Med Rev,2003:8(3):223-246.

[6] 王良宏,肖林生.系統性紅斑狼瘡患者血中 Vα24-Vβ11 NK T細胞介導的免疫調節失調機制研究 [J].陜西醫學雜志,2008,37(7):773-775.

[7] Renno T.Cytokine production by cells in the cerebrospinal fluid during EAE in SJI/J mice[J].J Neuroimmunol,1994:49(1-2):1-7.

[8] 呂雪瑩,張鳳蘊,王麗群,等.實驗性變態反應性腦脊髓炎 IFN-γ及IL-4檢測 [J].哈爾濱醫科大學學報,1999,33(1):13-13.