血管內(nèi)皮生長因子、微血管密度和促紅細胞生成素在子宮腺肌病中的作用探討

第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安 710032)

劉朵朵 王寶玲*

子宮腺肌病(Adenomyosis,AMS)與腫瘤一樣依賴于血管生成(Angiogenesis),血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種關鍵的促血管生成因子,微血管密度(Microvascular density,MVD)則是反映血管生成的定量指標,促紅細胞生成素(Erythmpoietin,EPO)是參與調(diào)控血管生成的血管生長因子,廣泛地參與了多種細胞的生長和凋亡等各種生理和病理過程。本研究觀察V EGF、MVD及EPO在子宮腺肌病子宮內(nèi)膜中的表達,以探討其在該疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料與方法

1 材料選擇 隨機抽取 2004～2008年陜西省婦幼保健院收治的子宮腺肌病患者行開腹或腹腔鏡手術(shù)取異位內(nèi)膜標本 40例作為研究組,患者年齡 23～46歲,其中增生期21例,分泌期19例。同期隨機抽取因各種良性疾病行開腹或腹腔鏡手術(shù)取子宮內(nèi)膜標本 39例作為對照組,患者年齡24～49歲,其中增生期20例,分泌期19例。兩組標本術(shù)后均經(jīng)病理證實,且在年齡、內(nèi)膜分期方面的差別比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),術(shù)前6個月均未使用過激素類藥物和未放置宮內(nèi)節(jié)育器。

2 方 法

2.1 取材:實驗組手術(shù)時取腺肌病病灶組織 1份,對照組手術(shù)時取正常子宮內(nèi)膜組織 1份,立即用10%甲醛固定,常規(guī)脫水及石蠟包埋,每份標本常規(guī)行HE染色后光鏡下觀察組織學形態(tài),篩選組織標本。用APES進行防脫片處理,切片厚度為4μm,撈片后置烤箱 60℃,2h取出,切片脫蠟至水。

2.2 免疫組織化學檢測:采用免疫組化 SABC法,實驗步驟按試劑盒說明進行,以微波枸櫞酸鹽進行抗原修復,DAB顯色,同時用 PBS代替一抗作為染色的陰性對照。VEGF、MVD檢測用已知的陽性乳腺癌切片作陽性對照,EPO檢測用已知的EPO染色陽性的胎兒腎臟組織切片作為陽性對照。本研究一抗選用VEGF多克隆抗體、鼠抗人單克隆抗體(武漢博士德生物工程公司提供)或鼠抗人CD34單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)。SABC免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程公司。

2.3 結(jié)果判定:高倍顯微鏡下全面觀察每張切片,隨機選擇 5個具有代表意義的高倍視野:VEGF檢測:采用上海山富科學儀器有限公司 Biosens Digital Imaging System進行分析,用平均灰度反映陽性強度;MVD檢測:計數(shù)5個高倍視野所有染色的微血管,取其平均值作為該切片的MVD;EPO檢測:高倍顯微鏡(10×40)下觀察該 5張切片視野中細胞著色情況,胞質(zhì)、胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色者為陽性細胞。綜合陽性細胞所占比例和染色強度進行半定量判定,參照文獻[1]作為評分標準。計算陽性細胞百分數(shù)(5個視野的平均數(shù)),無表達者為陰性(0分),1%～15% 者為可疑陽性(1分),16%～50%者為弱陽性(2分),51%～85%者為陽性(3分),86%～100% 者為強陽性(4分)。按公式[(陽性細胞表達強度×陽性細胞百分數(shù))/2]計算該標本的陽性指數(shù)。

3 統(tǒng)計學方法 應用 SPSS11.5統(tǒng)計學軟件進行處理,所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差(±s)表示,計量資料兩均數(shù)差異比較采用t檢驗或t’檢驗。

結(jié) 果

VEGF、MVD及EPO在兩組子宮內(nèi)膜中的表達結(jié)果,見附表。由附表可見,在整個月經(jīng)周期中腺上皮細胞均有 VEGF表達,在間質(zhì)細胞中只有散在表達。VEGF腺肌病組在增生期及分泌期異位內(nèi)膜中的表達與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。MVD腺肌病組在增生期及分泌期異位內(nèi)膜中的表達與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。EPO在腺肌病組中以陽性或強陽性表達為主,棕黃色顆粒集中于胞質(zhì),胞核少量表達,明顯高于對照組,與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01);腺肌病組子宮內(nèi)膜的陽性指數(shù)明顯高于對照組,與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。

附表 VEGF、MVD及EPO在兩組子宮內(nèi)膜中的表達比較(±s)

附表 VEGF、MVD及EPO在兩組子宮內(nèi)膜中的表達比較(±s)

與對照組比,*P＜0.05,△P＜0.01

對照組 39 42.16±0.52* 54.26±0.32* 13.8±1.20* 21.8±1.16* 4.08±1.52△ 4.27±2.12△

討 論

子宮腺肌病(Adenomyosis,AMS)患者與多次妊娠和分娩時子宮壁創(chuàng)傷和慢性子宮內(nèi)膜炎等刺激局部血管增生,利于子宮內(nèi)膜組織侵入子宮肌層,并與高雌激素水平有關。血管生成不僅在子宮內(nèi)膜的生長修復中起作用,而且對子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)的發(fā)生發(fā)展也有重要作用。促使血管生成的因子有V EGF,FGF-2(纖維細胞生長因子-2),IL-8(白細胞介素-8),EGF(表皮生長因子)和Epo(促紅細胞生成素)[2]等。其中VEGF能刺激血管生成,被認為是作用最強的促血管生成因子[3],推測其有可能通過自分泌或旁分泌的方式調(diào)控著異位內(nèi)膜的生長、種植和發(fā)展。

VEGF主要由巨噬細胞分泌是一種高度特異性的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂原,最先從腫瘤細胞分離出來,是一種結(jié)合肝素的二聚體蛋白,其糖蛋白單體以二硫鍵結(jié)合成二聚體才有活性,是通過酪氨酸激酶傳導通路發(fā)揮作用的。現(xiàn)已證實VEGF及其家族成員不單在腫瘤血管生成,在其它生理和病理的血管生成中都是必不可少的誘導因子。VEGF在胚胎發(fā)育、女性生殖周期、傷口愈合等正常生理過程和腫瘤、炎癥等病理生理過程中均是調(diào)控血管生成的關鍵細胞因子。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)VEGF的生物學作用有:①特異地促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂和血管生成。②體外無血清培養(yǎng)內(nèi)皮細胞時作為生長因子促進 Bcl-2和AI等抗凋亡蛋白表達。③促進纖溶酶原激活物、金屬蛋白酶和間質(zhì)膠原酶的表達,致使細胞非基質(zhì)降解和腫瘤細胞擴散。④增加血管的通透性和血漿蛋白外滲,為血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞生長提供良好的物質(zhì)基礎。其它血管生成因子的血管生成作用全部或部分通過增強VEGF的表達及生成作用來實現(xiàn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),子宮腺肌病異位內(nèi)膜中VEGF的表達無論在增生期還是分泌期均明顯高于對照組,提示異位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜有明顯的不同,VEGF的過度表達可能與這種內(nèi)膜腺體及間質(zhì)的遷移生長有密切關系。

MVD是評價血管生成的指標,CD34為血管內(nèi)皮細胞的特異性標記物[4],它的表達有助于進行微血管密度(MVD)的定量分析,反映子宮內(nèi)膜新生毛細血管的生長情況。子宮內(nèi)膜組織中MVD越高說明新生毛細血管越豐富。本研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜中均有 CD34的表達,但在異位內(nèi)膜 CD34明顯高于正常內(nèi)膜,提示子宮腺肌病異位內(nèi)膜一旦脫落逆流,則具有較強的微血管增生能力,有利于異位種植生長。子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展與內(nèi)膜組織的侵襲及血供的支持密切相關,此過程受多種細胞因子及蛋白水解酶的調(diào)控。

EPO是一種糖蛋白激素,由 165個氨基酸組成,早期由胎肝產(chǎn)生,后逐漸轉(zhuǎn)移至腎臟產(chǎn)生,成年后主要由腎小管間質(zhì)細胞分泌。作為一種細胞因子廣泛地參與了多種細胞的生長和凋亡等各種生理和病理過程,EPO其作用也不僅僅是促進紅系細胞的發(fā)育,而且參與了抗凋亡、抗缺氧、促進新生血管生成等病理生理學過程。本研究結(jié)果顯示,腺肌病患者異位內(nèi)膜腺上皮EPO的表達強度明顯高于對照組,而且 EPO主要集中于子宮內(nèi)膜腺體細胞,這與韓燕華等[5]報道相似,推測EPO的這種異常增高可能參與了腺肌病的發(fā)病過程。子宮腺肌病患者異位內(nèi)膜可能因 EPO過度表達而表現(xiàn)出比正常子宮內(nèi)膜更強的血管生成能力,腺肌病患者 EPO表達增強提示腺肌病中血管生成處于較活躍的狀態(tài),子宮內(nèi)膜間質(zhì)血管滲透性增加,并導致間質(zhì)水腫和纖維素沉積,可以誘導血管生成,為子宮內(nèi)膜侵入子宮肌層創(chuàng)造條件,異位病灶具有很強的血管生成能力得以存活,使異位內(nèi)膜獲得血供而進一步侵襲、發(fā)展,病灶不斷擴大,加速異位內(nèi)膜的種植。

我們的研究表明,VEGF、MVD和EPO參與調(diào)控血管生成,在子宮內(nèi)膜侵襲種植及新生血管形成網(wǎng)絡過程中起重要作用,它在組織中的表達反映了該組織的血管生成活性程度,與子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展關系密切。

[1] Watanabe H,Kanzaki H,Narukawa S.Bcl-2 and Fas expression in eutopic and ectopic human endometrium during themenstrual cyclein relation to endometrial cell apoptosis[J].Am JObstet Gynecol,1997,176:360-368.

[2] Jaquet K,Krause K,Tawakol-Khodai M.Erythropoietin and V EGF exhibit equal angiogenic potential[J].Microvasc Res,2002,64(2):326-333.

[3] Li HM,Zhao AZ,Dou HF,etal.Expression of VEGF in hepatic hemangioma and its clinical implication[J].Fourth Mil Med Univ,2002,23(7):606-607.

[4] Kimura H,Fnakajima.Kingiogensis in hepatocellular carcinoma as evaluated by CD34 immunohistochemistry[J].Liver,1998,18:14-19

[5] 韓燕華,周應芳,鄭淑蓉.子宮腺肌病患者血管內(nèi)皮生長因子表達的研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2002,9:539-541.