體外hEGF對食管癌EC9706細胞增殖影響的研究

華北煤炭醫學院中醫學系(唐山063000)

賈永森 司富春* 呂翠田* 王媛媛Δ

近年來食管癌的臨床和實驗研究大都著眼于分子生物學上、下游技術檢測癌細胞本身分子水平含量的變化或者藥效對其干預作用,而有關體外干預食管癌細胞增殖機制的研究尚不多見。

表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)是體外最強的促表皮細胞生長因子之一,由 Stanley Cohen在小鼠頜下腺分離純化(m EGF),隨后發現人胃酸分泌抑制因子(Urogastrone,UG)即人表皮生長因子(h EGF)主要在頜下腺合成。實驗證明,當有 EGF持續存在時,細胞呈多層性生長,其密度可達對照組的4～6倍[1]。本研究觀察了h EGF對高分化食管鱗癌細胞株 EC9706增殖的影響。

材料與方法

1 材 料 人食管癌細胞株 EC9706由中國協和醫科大學腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈;人表皮生長因子(h EGF)(sigma公司);RPMI 1640培養基(GIBCO公司);小牛血清(BCS)(GIBCO公司);胰蛋白酶(華美公司);MTT(Amresco公司);DMSO(Amresco公司);RNase A(sigma公司);碘化丙啶(PI)(sigma公司)

2 方 法

2.1 細胞培養:從液氮中取出凍存的EC9706細胞,37℃水浴使之解凍。吸出細胞懸液,移入離心管中,補加 10ml RPMI 1640培養液,吹打、混勻,1000rpm×10min離心,棄上清,加入含 10%小牛血清的RPMI1640培養液 10ml,吹打混勻后接種于Φ100mm培養皿中,置于培養箱培養。每 2～3天傳代1次。

2.2 MTT實驗

2.2.1 量效關系:5×104個/0.5ml細胞懸液,接種于24孔平面培養板中,500μl/孔。置 37℃、5%CO2培養箱中,細胞貼壁 24h后,棄上清,以不含血清培養液清洗各孔貼壁細胞中殘留血清成分,600μl/孔,重復1次。加入不含血清培養液 500μl/孔,饑餓細胞 24h,棄舊培養液,以不含血清 RPMI1640培養液配制不同濃度 hEGF工作液:400ng/ml,200ng/ml,100ng/ml,50ng/ml,25ng/ml,12.5ng/ml 6個梯度,每組 3個復孔,同時對應 2個復孔加入不含血清培養液,做空白平行對照,500μl/孔。繼續培養 24h后,吸去上清液,MTT法測定光吸收值(OD值),實驗重復 3次。按照公式:

h EGF刺激 EC9706細胞增殖率=(hEGF組 OD值 /對照組 OD值-1)×100%繪制量效關系曲線圖,確定hEGF最高刺激增殖濃度。

2.2.2 時效關系:細胞培養同 2.2.1,以不含血清培養液配制h EGF最高刺激細胞增殖濃度,加入24孔板 3～6列共 16個復孔中作為h EGF組,1～2列 8個復孔加入不含血清培養液作為空白對照平行復孔,分別于12h、24h、36h、48h測定第 1、2、3、4行OD值,方法同 2.2.1。實驗重復 3次。

繪制時效關系曲線圖,觀察h EGF刺激細胞增殖與時間的關系。

2.3 鏡下觀察hEGF對人食管癌 EC9706細胞增殖和形態的影響:以 1×106個細胞 /皿的密度接種EC9706細胞于Φ100mm培養皿中,10ml/皿,于37℃,5%CO2,飽和濕度的CO2培養箱培養 24h,棄舊培養液,加入不含血清培養液 10ml/皿,饑餓細胞 24h,加入h EGF(最高刺激濃度),空白對照組加不含小牛血清的培養液 10ml/皿,入培養箱繼續培養,分別于12h、24h、36h在倒置顯微鏡下觀察空白對照組和hEGF組的EC9706細胞增殖情況和形態學變化。

2.4 流式細胞術分析h EGF對 EC9706細胞周期的影響:以 1×106個細胞 /皿的密度接種 EC9706細胞于Φ100mm培養皿中,10ml/皿,共 4皿。于37℃,5%CO2,飽和濕度的CO2培養箱培養 24h,棄舊培養液,加入不含血清培養液 10ml/皿,饑餓細胞 24h,3皿加入含h EGF(最高刺激濃度)無血清培養液,1皿空白對照加入無小牛血清的培養液,10ml/皿,均入培養箱繼續培養。hEGF組三皿分別在 12h、24h、36h時間點收集,空白無血清對照組在 24h時間點收集。在相應時間點以3ml/皿 Trypsin消化,并收集入15ml離心管中,1000rpm×10min離心,棄上清液,加入PBS 2ml,重懸細胞,1000rpm×5min離心,重復 1次。棄掉 PBS,加入PBS 100μl以微量移液器吹打混勻,避免氣泡產生,加入70%乙醇固定細胞,放入4℃過夜。待 4管細胞均收集完畢,將固定細胞以 200g×5min離心,棄掉乙醇,并在 3ml預冷的PBS中重懸細胞,靜息 1min,200g×5min,重復 1次。棄掉 PBS,依次加入PBS 850μl,10mg/ml RNase A 10μl,1% TritonX-100 100μl,1mg/ml PI 40μl,37℃下避光孵育5min。用400目篩網過濾細胞,上流式細胞儀用Cellquest Pro進行細胞周期分析,并用Modfit LT細胞周期分析軟件分析結果,得出不同組別細胞在各細胞周期的百分比率。

結 果

1 h EGF對人食管癌EC9706細胞增殖刺激的量效關系,見表1、圖1。

表1 不同濃度 EGF對 EC9706細胞增殖的影響(MTT法)(±sD)

表1 不同濃度 EGF對 EC9706細胞增殖的影響(MTT法)(±sD)

增殖率比較:與200ng/ml濃度時相比,* :P＜0.01;Δ:P＜0.05

?

圖1 不同濃度 EGF對 EC9706細胞增殖影響的關系

從表1和圖1可以看出,12.5ng/ml到 400ng/ml 6個梯度濃度的細胞培養 24h,細胞生長 OD值總體隨著濃度的升高而增加,提示細胞數目增多,在 200ng/ml濃度時,OD值達峰值,與空白對照孔細胞相比,增殖率為51.8%,到 400ng/ml濃度時,增殖率下降,提示細胞增殖飽和。組間增殖率比較,在200ng/ml濃度時,增殖率與其他濃度時相比,分別提示顯著性差異(P＜0.05)和極顯著性差異(P＜0.01),提示此濃度時 h EGF對 EC9706細胞刺激作用最明顯。

2hEGF對人食管癌 EC9706細胞增殖刺激的時效關系,見表2、圖2。

圖2 h EGF(200ng/ml)對 EC9706細胞增殖影響時效關系

表2 不同時間h EGF(200ng/ml)對 EC9706細胞增殖的影響(MTT法)(±sD)

表2 不同時間h EGF(200ng/ml)對 EC9706細胞增殖的影響(MTT法)(±sD)

增殖率比較:與24h時間點相比,* :P＜0.01;Δ:P＜0.05

24 1.696±0.131 2.651±0.112 56.3±1.9 36 1.327±0.098 1.857±0.057 40.1±1.5Δ 48 0.916±0.102 1.062±0.063 16.0±2.3*

從表2和圖2可以看出,以同一h EGF濃度 200ng/ml作用的EC9706細胞在 12h與空白對照組相比即有小幅度的增殖,增殖率為18.9%;在此后一直到24h,可以看出細胞增殖呈大幅度上升,到 24h時間點達到峰值 56.3%,兩時間點比較具有極顯著性差異(P＜0.01);此后的36h、48h,細胞增殖呈顯著下降趨勢,分別與24h時間點比較,具有顯著性差異(P＜0.05)和極顯著性差異(P＜0.01)。提示在 24h時間點,hEGF對EC9706細胞的刺激作用最強。

3 h EGF對人食管癌 EC9706細胞增殖和形態的影響,見圖3。

圖3 h EGF對 EC9706細胞增殖和形態的影響

在倒置顯微鏡下觀察,空白無血清對照組細胞呈扁平多角形,具有典型的上皮型細胞生長特性,隨饑餓時間延長,逐漸有細胞形態變圓、并有透亮區,呈脫壁狀態。12h EGF組鏡下觀察可見EGF(200ng/ml)組細胞密度高于空白對照組,細胞呈長梭形改變,有較長突起,互相連接成網狀,細胞之間連接不甚緊密,24h細胞連接緊密,數目明顯多于12h EGF組,均呈貼壁生長,繼續呈長梭形改變,36h EGF組可見貼壁細胞有少量呈圓形改變,細胞周緣有透亮區,逐漸有細胞脫壁,細胞數目顯著減少,鏡下單個細胞呈透亮狀態。

表3 h EGF刺激的EC9706細胞周期分布(%)(±sD)

表3 h EGF刺激的EC9706細胞周期分布(%)(±sD)

S+G2 M期細胞百分率比較:與24h時間點相比,* P＜0.01;Δ P＜0.05

h EGF(36h)60.10±1.02 15.62±1.53 24.29±2.58 39.66±1.73Δ

4 h EGF對人食管癌 EC9706細胞周期的影響:從四組的細胞周期 FCM分析結果來看(表3),h EGF三組細胞 S+G2 M期細胞比率均明顯高于空白對照無血清組,細胞周期中 S+G2M期的比例反映了細胞群體中細胞增殖的程度,24h收集的h EGF刺激細胞 S期比率較之空白對照和h EGF12h、36h顯著升高。從S+G2 M期分析,24h的hEGF組與空白對照相比,百分率增高 47%以上,這與MTT檢測結果一致。24h時間點與其他三個時間點比較,具有顯著性差異(P＜0.05),提示 24h時hEGF促進細胞過渡到增殖周期的數目達到峰值。

討 論

EGF是體外最強的促表皮細胞生長因子之一,能誘導蛋白質中酪氨酸殘基磷酸化水平增高,提高細胞內代謝水平。在腫瘤的發生、發展過程中,EGF作為一種重要的絲裂原,與其受體結合后可激活多種信號轉導通路來調節細胞的生長、增殖及分化[2]。近年的研究表明,EGF與腫瘤的發生、發展密不可分。

我們以 24孔板種植細胞,MTT法檢測了細胞增殖情況。在較低濃度時,細胞生長受到抑制,推測由于EGF濃度較低,各細胞之間膜表面受體 EGFR出現受體競爭性抑制;當濃度達到 200ng/ml時,細胞增殖率達到 51.8%,提示此濃度的h EGF能刺激細胞較明顯的增殖。

EGF作為有絲分裂源性生長因子,對腫瘤細胞的形態影響非常明顯,可以看到細胞在被刺激 12h后為長梭型改變,并伸出觸角狀細胞突起,呈現遷移能力的增強。在24h時EGF對細胞刺激增殖能力最強,此時細胞遷移能力活躍,細胞以減弱細胞貼壁狀態來完成增殖細胞的轉移,細胞繼續呈長梭形改變,有較長突起。細胞由扁平的多角形上皮型細胞轉變成長梭形,這種細胞形態的轉變,即上皮細胞-間葉樣變(Epithelialmesenchymal transition,EMT),可以視為細胞侵襲的一種標志,有利于腫瘤細胞的浸潤和轉移[3]。

細胞周期(Cell cycle)是指親代細胞分裂結束到子細胞分裂結束之間的間隔時期。一個典型的細胞周期有 4個期即 G1-S-G2-M構成,并受到胞內外信號傳導途徑及反饋環路的調控。細胞周期調控異常是癌變的重要機制。惡性腫瘤細胞的周期調控失控,使細胞分化受阻,處于過度增殖狀態[4]。細胞周期中S+G2M期的比例反映了腫瘤細胞群體中處于增殖階段的數量,從一定程度上代表了細胞增殖狀態[5]。我們以 200ng/ml濃度觀察了hEGF刺激的EC9706細胞周期的變化。以流式細胞儀分析了空白對照、EGF(12h)、EGF(24h)、EGF(36h)的細胞周期變化:EGF刺激細胞 12h后,S+G2M期細胞比率比空白對照高出 6.9%,到 24h時,S+G2M期增高 47%,其中 S期在達到 30%,提示hEGF刺激細胞由 G1期過渡到 S期,36h時,S期、G2M期以及S+G2 M期均比24h明顯下降,提示h EGF刺激細胞增殖在24h達峰值。

我們的實驗結果表明,hEGF能夠刺激 EC9706細胞由生長抑制的G1期過渡到 S期,從而達到促增殖作用。有關h EGF通過何途徑引起細胞的增殖,是否涉及到蛋白質信號轉導通路的調節機制?我們將進行更深入的研究。

[1] Ozawa S,Kitagawa Y,Kitajima M.Molecular alteration sin esophageal cancer.Nippon Geka Gakkai Zasshi,2002,103(6):457-462.

[2] 劉友平,丁慧榮,吳民瀘,等.高濃度 EGF對小鼠肝細胞信號轉導的動力學研究.陜西醫學雜志,2005,34(6):643-649.

[3] 馬常慧,陳海濱.腫瘤壞死因子受體 I的信號傳導與腫瘤的關系.汕頭大學醫學院學報,2008,21(1):58-60.

[4] 劉中宏,鄭長青,喻衛紅.Survivin短發夾狀 RNA對結腸癌 SW480細胞增殖和細胞周期的影響.腫瘤學雜志,2008,11(3):186-189.

[5] 王愛紅,王明全,龐秋霞,等.番茄紅素對乳腺癌 MDAMB-231細胞周期和增殖的影響.陜西醫學雜志,2008,37(11):1482-1484.