瘦素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞硬脂酰輔酶A去飽和酶-1基因表達(dá)的影響△

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌科(哈爾濱 150001)

閆 爽 劉思穎 封 泉 崔新河*

硬脂酰 CoA去飽和酶-1(Stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1)是單不飽和脂肪酸生物合成的限速酶,在脂肪酸代謝中起中心調(diào)節(jié)作用,也是瘦素(Leptin)作用的目的基因之一。瘦素與糖尿病、肥胖、脂肪肝有著密切關(guān)系,是近年來(lái)代謝性疾病的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。2型糖尿病患者,常常伴有胰島素抵抗、高瘦素血癥,同時(shí)約50%的2型糖尿病患者存在脂肪肝。本文采用 RT-PCR方法觀(guān)察瘦素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞SCD-1基因表達(dá)的影響。

材料與方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)和總RNA提取 在35 mm培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng) HSC細(xì)胞(由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供),細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí),分別用瘦素(濃度為100 ng/ml,為實(shí)驗(yàn)組)和對(duì)照液體(對(duì)照組)培養(yǎng) HSCs細(xì)胞,36 h后收獲細(xì)胞提取總 RNA。應(yīng)用 Trizol一步法提取細(xì)胞的總RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)進(jìn)行定性定量分析。

2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 將定量的總 RNA用 SYBR Ex Script RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄總 RNA。反轉(zhuǎn)錄條件:42℃ 13min,95℃ 2min;反轉(zhuǎn)錄體系:5×Exscript TM緩沖液:2μl,dN TP混合物(各10mM):0.5μl,Random 6mers 反轉(zhuǎn)錄引物(100μM):0.5μl,Exscript TM Rtase反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl):0.25μl,RNase抑 制劑(40U/μl):0.25μl,總 RNA:500ng,無(wú) RNase純水:總量至10μl,總體積:10μl。

3 引物的合成 根據(jù) RT-PCR引物合成的要求,根據(jù)SCD-1和GAPDH基因序列應(yīng)用N TI軟件設(shè)計(jì)引物如下(由上海生物工程有限公司合成):SCD-1上游引物 P1:5′-TGGGTTGGCTGCTTGTG-3′(17bp),下游引物 P2:5′-GCGTGGGCAGGATGAA G-3′(17bp),GAPDH上游引物 P1:5′-ATGATTCT ACCCACGGCAAG-3′,下游引物 P2:5′-CTGGAA GATGGTGATGGGTT-3′。

4 RT-PCR反應(yīng) 使用 Light Cycler PCR儀進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。將對(duì)照組模板cDNA進(jìn)行5倍的倍比稀釋,設(shè)未稀釋的模板cDNA濃度為1,則稀釋后的濃度梯度為1、0.2、0.04、0.008、0.0016,以此五個(gè)濃度的cDNA為模板,對(duì) SCD-1基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,以 CT值做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。同時(shí)以未稀釋的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 cDNA為模板,對(duì) SCD-1基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,以 ct值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的位置來(lái)計(jì)算 SCD-1基因在瘦素刺激前后的相對(duì)含量。反應(yīng)體系為:SYBR Green熒光染料:10μl,dd H2O:8.2μl,引物 P1:0.4μl,引物 P2:0.4μl,模板:1.0μl,終體積:20μl。反應(yīng)條件為:95℃,10s;95℃,5s→60℃,20s,45個(gè)循環(huán)。

結(jié) 果

1 總 RNA的定性、定量分析:使用高質(zhì)量的總RNA是保證cDNA高質(zhì)量的前提。核酸-蛋白分析儀A260/A280檢測(cè)結(jié)果:經(jīng)過(guò)瘦素處理過(guò)的和未用瘦素處理的肝星狀細(xì)胞提取的總 RNA分別為0.653μg/μl和0.712μg/μl,A260/A280分別為1.924和1.963。1.0%瓊脂糖凝膠電泳如圖1。

圖1 總 RNA電泳圖

2 RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖及融解曲線(xiàn)圖,見(jiàn)圖2。

圖2 SCD-1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

圖3 SCD-1基因溶解曲線(xiàn)圖

3 RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:瘦素對(duì) SCD-1的調(diào)節(jié)。RT-PCR實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率r=1,根據(jù) RT-PCR的調(diào)節(jié)倍數(shù)計(jì)算公式:調(diào)節(jié)倍數(shù)=(實(shí)驗(yàn)組測(cè)試基因拷貝數(shù) /實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因拷貝數(shù))÷(對(duì)照組測(cè)試基因拷貝數(shù) /對(duì)照組內(nèi)參基因拷貝數(shù)),計(jì)算得出瘦素刺激后SCD-1基因的擴(kuò)增是未用瘦素刺激的0.315倍。

討 論

隨著肥胖和2型糖尿病發(fā)病率的增加,2型糖尿病并發(fā)脂肪肝也明顯增加,肝內(nèi)的脂肪沉積會(huì)影響肝臟功能的正常發(fā)揮,加重糖代謝紊亂,形成惡性循環(huán),嚴(yán)重影響糖尿病人的預(yù)后。發(fā)現(xiàn) 2型糖尿病并發(fā)脂肪肝的可能病因,有利于尋找防治 2型糖尿病并發(fā)脂肪肝的途徑。非酒精性脂肪肝主要是由于中性脂肪在肝臟中沉積所引起,糖尿病人脂代謝紊亂是其非酒精性脂肪肝形成的原因之一。而糖尿病人的脂代謝紊亂又和瘦素有著復(fù)雜的關(guān)系。

瘦素是一種脂肪組織來(lái)源的親水多肽激素,分子量為16000,含146個(gè)氨基酸。Zhang Y等[1](1994年)首次克隆出瘦素基因或稱(chēng)肥胖基因(Obese gene,Ob基因)。瘦素的功能是多方面的,主要表現(xiàn)在對(duì)脂肪及體重的調(diào)控[2～5]。瘦素通過(guò)肝臟、胰腺、骨骼肌、脂肪組織等發(fā)揮其調(diào)節(jié)能量代謝、保持機(jī)體能量平衡的作用。對(duì)瘦素與脂肪代謝之間關(guān)系的研究表明,生理狀態(tài)下,脂肪組織增生則分泌更多瘦素而加速脂肪分解,使機(jī)體的脂肪量和體重維持相對(duì)穩(wěn)定,而代謝綜合征狀態(tài)下,患者存在瘦素抵抗,使得瘦素不能正常發(fā)揮對(duì)脂肪代謝的調(diào)控作用,同時(shí)攝食增加,脂肪氧化分解減弱,脂肪蓄積,從而導(dǎo)致高脂血癥,進(jìn)一步導(dǎo)致脂肪肝,同時(shí)亦影響了胰島素的生物學(xué)效應(yīng)[6,7]。瘦素與胰島素之間關(guān)系的研究最為廣泛。胰島素被認(rèn)為是血漿瘦素濃度的決定因素,參與調(diào)節(jié)熱卡攝入對(duì)瘦素的效應(yīng)。更為重要的是瘦素與胰島素之間存在有負(fù)向調(diào)節(jié)袢:胰島素刺激瘦素分泌,同時(shí)瘦素通過(guò)與胰島細(xì)胞上的受體結(jié)合來(lái)抑制胰島素的分泌。這種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制一旦破壞,瘦素抑制胰島素分泌的能力即下降,導(dǎo)致高胰島素血癥,或胰島素抵抗發(fā)生,進(jìn)一步發(fā)展為2型糖尿病[8,9],同時(shí)更加促成了糖尿病人高瘦素血癥的形成。

硬脂酰 CoA去飽和酶(SCD)是單不飽和脂肪酸(Monounsaturated fattyacid,MUFA)生物合成的限速酶,在脂肪酸代謝中起中心調(diào)節(jié)作用。MUFA從其前體飽和脂肪酸經(jīng)NADH依賴(lài)的黃素蛋白細(xì)胞色素 b5還原酶、細(xì)胞色素 b5和SCD三種物質(zhì)組成的酶系催化,無(wú)氧氧化而來(lái)。SCD催化硬脂酰和軟脂酰 Co A形成油酰和棕櫚油酰 CoA。生成的油酰和棕櫚油酰 CoA是細(xì)胞內(nèi)合成三酰甘油、膽固醇酯和膜磷脂 M UFA的主要來(lái)源。油酸是肝合成三酰甘油和膽固醇酯的必需脂肪酸,三酰甘油和膽固醇酯是肝內(nèi)裝配和分泌極低密度脂蛋白(VLDL)的重要成份。因而,SCD是調(diào)節(jié)VLDL水平的控制點(diǎn)。SCD主要有三種同功酶:SCD1、SCD2和SCD3。SCD1主要存在于肝、腎、肺、心臟和脾。2002年,Cohen等[10]研究發(fā)現(xiàn),SCD-1基因是瘦素信號(hào)的靶基因之一,瘦素可顯著抑制 SCD-1基因的表達(dá)。本組資料也顯示:在體外實(shí)驗(yàn),一定濃度的瘦素刺激后,SCD-1m RNA水平明顯低于對(duì)照組,說(shuō)明瘦素可以使 SCD-1基因表達(dá)下調(diào),與國(guó)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。SCD-1mRNA水平下降,可使VLDL分泌降低,肝內(nèi)多余脂肪不能排出,在肝內(nèi)沉積形成脂肪肝。Cohen同時(shí)發(fā)現(xiàn),SCD-1缺乏的ob/ob鼠三酰甘油合成和VLDL分泌減少,由此認(rèn)為:SCD-1作為脂代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶,參與了脂肪肝的發(fā)病過(guò)程。由于SCD-1是V LDL的調(diào)控點(diǎn),參與脂肪肝的發(fā)生,瘦素又減少SCD-1的分泌,糖尿病人由于胰島素抵抗、瘦素抵抗,其脂肪肝的形成很可能與其內(nèi)源性的高瘦素血癥有關(guān),使得肝細(xì)胞的SCD-1表達(dá)下調(diào),VLDL分泌降低,肝內(nèi)脂肪不能排出,形成脂肪肝。如果改善瘦素抵抗,糾正糖尿病人的高瘦素血癥,預(yù)防和減輕 SCD-1表達(dá)下調(diào),可能有助于脂肪肝的改善,瘦素作用的詳細(xì)機(jī)制以及與各種相關(guān)代謝途徑關(guān)系的研究,瘦素抵抗發(fā)生的真正原因、瘦素與胰島素抵抗的關(guān)系、瘦素與2型糖尿病合并脂肪肝的關(guān)系如何,均有待深入研究,這對(duì)與瘦素相關(guān)的代謝性疾病的發(fā)生將起到更好的解釋和防治作用。而 SCD-1與瘦素的進(jìn)一步深入研究亦為非酒精性脂肪肝,其中包括糖尿病脂肪肝臨床研究和藥物開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)新的方向和可能的治療靶點(diǎn)。

[1] Zhang Y,P roenca P,M affeiM,etal.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue[J].Nature,1994,372(6505):425-432.

[2] Houseknecht KL,Spurlock ME.Leptin regulation of lipid homeostasis:dietary and metabolic imp lications[J].Nutrition research reviews,2003,16(1):83-96.

[3] Caro J F,Sinha M K,Kolaczynski JW,etal.Leptin:the tale of an obesity gene[J].Diabetes,1996,45(11):1455-1462.

[4] Shek EW,BrandsM W,Hall JE.Chronic leptininfusion increases arterial pressure[J].Hypertension,1998,31(1 Pt 2):409-414.

[5] Lord GM,Matarese G,Howard JK,etal.Leptin modulates the T2 cell immune response and reverses starvation induced immunosuppression[J]. Nature,1998,349(6696):897-901.

[6] Sahu A,Metlakunta AS.Hypothalamic phosphatidylinositol 3-ki-nase-phosphodiestrase 3B-cyclic AMP pathway of leptin singnaling is impaired following chronic central leptin infusion.J Neuroendocrinol,2005,17:720-726.

[7] Covey SD,Wideman RD,Mc Donald C,etal.The pancreatic beta cell is a key site for mediating the effects of leptin on glucose homeostasis.Cell Metab,2006,4:291-302.

[8] Munzberg H,Flier JS,Bjorbaek C.Region-specific leptin resistance within the hypothalamus of diet-induced obese mice.Endocrinology,2004,145:4880-4889.

[9] Martin TL,Alquier T,Asakura K,etal.Diet-induced obesity alters AM P-kinase activity in hypothalamus and skeletal muscle.JBiol Chem,2006,281:18933-18941.

[10] Cohen P,Miyazaki M,Socci ND,etal.Role for stearoyl-Co A desturase1 in leptin-mediated weight-loss.Science,2002,297∶240-243.