硒化殼聚糖對NB4細胞增殖的影響及其與端粒酶活性和hTERT基因表達的關系△

鄖陽醫學院附屬人民醫院腫瘤中心(十堰442000)

鄧守恒 曾小華* 曹鳳軍 類健翔 鄧守明# 陳 萍

急性早幼粒細胞性白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)是急性白血病中的一種。臨床上,維甲酸(Retinoic acid,RA)作為誘導分化劑可使大多數APL患者取得完全緩解,但會引起維甲酸相關綜合征及存在著嚴重的耐藥性,相當數量的APL患者在完全緩解后短期內復發。三氧化二砷可通過誘導細胞凋亡治療 APL,但低劑量的三氧化二砷無法誘導 RA耐藥的APL細胞分化或凋亡,而高劑量的砷及其化合物又可誘導多種不良反應使病人不能耐受[1]。化學結構上和砷屬同族的硒是人和動物體內必需的微量元素之一,具有顯著的防癌和抗癌作用。硒化殼聚糖[2]是利用亞硒酸和低分子殼聚糖通過拼合原理制備成的一種有機硒,理論上應該有抗 APL作用,且毒副作用應該比無機硒和砷小得多。本實驗觀察了硒化殼聚糖對體外培養的NB4細胞生長的抑制作用并探討了這種作用與細胞端粒酶活性和人端粒酶反轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,h TERT)基因表達的關系,現報告如下。

材料和方法

1 藥品試劑儀器 硒化殼聚糖(批號:100601-200518)由福建醫科大學藥物化學系合成,經福建省分析測試中心檢測,含硒量為0.4%,用培養液配成800mg/L的溶液待用;TRAPeze ELISA端粒酶檢測試劑盒購自intergen公司;Trizol總RNA抽提試劑盒、Revert AidTMfirst strand cDNA synthesis kit為Fermentas產品。細胞培養板購自丹麥Nunclon公司;DG-3022型酶標儀(中國南京);AM-PLITRONⅡ型PCR擴增儀(美國 Barnscread/Thermolyme公司)。

2 細胞及培養 人急性早幼粒細胞性白血病NB4細胞引自福建省血液病研究所,培養于體積分數為10%新生牛血清,100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素和2U/ml谷氨酰胺的RPMI 1640培養基內,于37℃、飽和濕度,5%CO2條件下培養。細胞接種24h后進入指數生長期。

3 MTT法檢測硒化殼聚糖對細胞生長的抑制作用 在96孔培養板上接種處于指數生長期的NB4細胞,每孔加細胞懸液 100Ul,接種量 5×104/ml。實驗孔加入等體積、不同濃度的硒化殼聚糖,對照孔加入等體積溶劑,設4個復孔。將培養板放至37℃,5%CO2培養箱中培養至所需時間,加入MTT溶液,繼續培養 4h后,離心,棄上清,加入二甲基亞砜(DMSO),顆粒完全溶解后用酶標儀在 550nm處測定每孔的光密度值,重復3次。生長抑制率=(空白組光密度-實驗組光密度)/空白組光密度×100%

4 端粒酶活性檢測[3]分別收集不同濃度硒化殼聚糖作用 48h后的NB4細胞各 2×105個,PBS洗 2次,采用 TRAPPCR-ELISA法,在酶標儀上 450nm和690nm處測定A值,設未加藥組為對照,結果△A值=A450-A690,△A值＜0.2為陰性,△A值＞0.8為陽性。

5 RT-PCR法檢測 NB4細胞h TERT mRNA的水平 收集各組細胞各 3～5×106個,加1ml Trizol,按說明提取細胞總RNA,要求能夠顯示出清晰的28s及18s兩條rRNA帶,取細胞總 RNA 1μg,小鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,M-MLV)200U,二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)0.2μmol/L,RNA酶抑制劑(RNase inhibitor,RNasin)20U,四種脫氧核糖核苷酸混合物(d NTP)20nmol/L,隨機引物100ng,總反應體系為20μl,42℃反應 1h,70℃10min中止反應。取合成的cDNA模板 2μl,上下游引物各15pmol/L,Taq酶1U,d NTP5nmol/L用于PCR,94℃30s,58℃45s,72℃60s,35個循環,最后72℃5min,取PCR產物各 10μl,在含0.5μg/ml溴化乙錠的2%瓊脂搪凝膠中進行電泳,紫外反射儀上觀察、拍照。引物由上海sangon合成,hTERT;5’-CCGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3';5'-GGATGA AGCGGACTCTGGA-3',擴增片段為145bp,β-actin:5'-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3';5'-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3',擴增片段為501 bp。

結 果

1 硒化殼聚糖對NB4細胞生長抑制作用,見圖1。MTT法檢測顯示,25～200mg/L的硒化殼聚糖對體外培養的NB4細胞生長均具有抑制作用,隨著作用時間的延長和藥物劑量的增加,抑制作用逐漸增強,呈現出明顯的時效和量效關系。

2 硒化殼聚糖對NB4細胞端粒酶活性影響結果,見附表。從表中可見,未加藥物組細胞內端粒酶活性較高,經 50 mg/L及以上濃度的藥物作用 48h后,端粒酶活性均有一定程度的下降,藥物濃度越高,端粒酶活性下降越明顯。50mg/L組與未加藥組比較有差異(P＜0.05),100、200 mg/L組與未加藥組比較有顯著差異(P＜0.01)。

附表 硒化殼聚糖對NB4細胞端粒酶活性的抑制作用(±s,n=4)

附表 硒化殼聚糖對NB4細胞端粒酶活性的抑制作用(±s,n=4)

注:與0mg/L組相比,* P＜0.05** P＜0.01

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3 硒化殼聚糖對NB4細胞h TERT mRNA水平的影響,見圖2。圖中 RT-PCR結果顯示,未加藥組細胞內 h TERTmRNA條帶明亮,經不同濃度藥物作用48h后,h TERTmRNA條帶則逐漸變淡,50mg/L藥物作用后,亮度約降至對照的一半,而經200mg/L藥物作用后,則條帶幾乎看不清楚,呈現出明顯的量效關系。

圖1 硒化殼聚糖對NB4細胞生長的抑制作用

圖2 硒化殼聚糖對 NB4細胞h TERTm RNA水平的影響

討 論

端粒酶是一種由 RNA和蛋白質組成的逆轉錄酶,其作用是在復制期(S期)的線粒體末端添加TTAGGG重復片段,以彌補染色體由于細胞分裂所出現的末端進行性縮短。端?？删S護染色體的完整性,并參與染色體在細胞核內的定位及基因表達調控。端粒的長短和穩定性決定了細胞的壽命,并與衰老和癌變密切相關[4]。大多數的研究表明,人類正常體細胞中端粒酶常處于失活狀態,而在多種腫瘤細胞內端粒酶呈陽性,在這些腫瘤細胞內由于缺乏調節端粒酶活性的機制,不能下調端粒酶活性使細胞停止分裂和退出細胞周期,從而使細胞無限增殖,獲得永生性,故而端粒酶活性的調節可能是腫瘤治療作用機制的一部分[5]。h TERT與端粒酶活性的發揮密切相關,h TERT m RNA水平在端粒酶活性高的細胞中往往上調[6],基于此,端粒酶活性和h TERT基因常被看作是評價抑癌效果的兩個重要指標。為此,本實驗觀察并探討了硒化殼聚糖對體外培養的NB4細胞生長的影響及其與端粒酶活性和h TERT基因表達的關系。

研究發現,硒化殼聚糖可使 NB4細胞的生長增殖受到抑制,25mg/L的硒化殼聚糖作用NB4細胞 24、48、72h,其抑制率分別為12.2%,13.7%,21.0%,抑制作用不太明顯,當其濃度升高至50mg/L時,抑制率則分別上升為18.3%,29.2%和53.4%,抑制作用顯著,再增加藥物濃度,則抑制率進一步升高。進一步通過檢測硒化殼聚糖作用48h后 NB4細胞內端粒酶活性和h TERT mRNA水平變化的結果表明,同對細胞生長的抑制作用特點相一致,經不同劑量硒化殼聚糖作用后,端粒酶活性和h TERT mRNA水平也呈劑量依賴性降低,說明硒化殼聚糖可以通過抑制NB4細胞端粒酶活性和h TERT表達來抑制細胞增殖。

有報道稱,端粒酶活性的升高與細胞周期蛋白表達呈正相關[7]。本課題組前期研究結果發現[8],硒化殼聚糖可下調NB4細胞周期蛋白D1的表達,從而使端粒酶活性降低,而后者又可使細胞染色體末端缺失,染色體缺失又會使基因組變得不穩定,從而誘導細胞發生凋亡,抑制了細胞的無序增殖,這可能也是硒化殼聚糖能抗 APL的原因之一。

[1] Cai X,Shen YL,Zhu Q,etal.Arsenic trioxide-induced apoptosis and differentiation are associated respectively with mitochondrial transmembrane potential collapse and retinoic acid signaling pathways in acute promyelocytic leukemia.Leukemia,2000,14:262-270.

[2] 鄧守恒,孫各琴,陳崇宏.Ca2+、cAMP、cGMP在硒化殼聚糖誘導的NB4細胞凋亡中的作用.陜西醫學雜志,2007,36(4):415-417.

[3] 衛立辛,郭亞軍,閆振林,等.檢測人端粒酶活性的端粒酶TRAP-ELISA法的建立 [J].中華腫瘤雜志,1998,20(4):264-266.

[4] 楊松鶴,楊振華,薛景鳳.衰老大鼠卵巢 SOD和端粒酶活性的變化及天年飲的保護作用.陜西中醫,2009,30(10):1423.

[5] Kim NW.clinical implications of telomerase in cancer[J].Eur JCancer,1997,33(5):781-786.

[6] Meyeson M,Counter CM,Eaton EN,etal.Hest2,the putative human telomerase catalytic subunit gene is upregulated in tumor cells and during immortalization[J].Cell,1997,90:785-796.

[7] 吳清明,于皆平,張衛國,等.阻斷泛素-蛋白酶體通路對胃癌細胞增殖和凋亡的影響[J].中華消化雜志,2004,24(2):102-105.

[8] 鄧守恒,孫各琴,陳崇宏.硒化殼聚糖對 NB4細胞的周期阻斷及與阿霉素的協同作用[J].中國藥房,2007,18(10):741-743.