白藜蘆醇對(duì)裸鼠移植性肝癌的抑制作用△

陜西省人民醫(yī)院肝膽外科(西安 710068)

孫中杰 余海波 張 煜 劉曉剛 杜立學(xué)

白藜蘆醇(Resveratrol,Res)具有降血脂、清除氧自由基、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤作用。它對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展多階段均有明顯的抑制效果。Whitsett等[1]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以顯著降低小鼠乳腺癌的發(fā)生率,Res能抑制小鼠肝癌細(xì)胞 H22的生長(zhǎng)[2]。在本實(shí)驗(yàn)中我們通過構(gòu)建人肝癌細(xì)胞系 Hep G2裸鼠皮下移植瘤的模型,觀察白藜蘆醇對(duì)移植瘤的抑制作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 白藜蘆醇Sigma公司產(chǎn)品,CD34單抗 Zymed公司產(chǎn)品;人肝癌 Hep G2細(xì)胞,西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科實(shí)驗(yàn)室傳代保存;BALB/c(nu/nu)雄性裸小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,雄性,6周齡,體重18～22g,在該中心 SPF級(jí)(Specific pathogen free)環(huán)境中飼養(yǎng)。

2 方 法

2.1 白藜蘆醇對(duì)裸鼠移植性肝癌的抑制作用:18只接種人肝癌細(xì)胞 Hep G2移植瘤裸鼠模型隨機(jī)分為3組,每組 6只:50mg/kg Res組,生理鹽水(NS)對(duì)照組,1%DMSO對(duì)照組。接種后第10天開始,每間隔2天腹腔給藥 1次,每只裸鼠腹腔注射大約 0.2～0.3ml,共注射10次。觀測(cè)指標(biāo):①腫瘤體積:每次給藥前以游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下腫瘤直徑,以腫瘤最大徑與腫瘤最小徑乘積(mm2)代表腫瘤大小。②腫瘤重量:末次給藥 24h后,脫椎處死裸鼠,解剖摘除皮下移植瘤,盡量剝離移植瘤表面包膜,分析天平稱重。

2.2 測(cè)定腫瘤微血管密度(Microvessel density,MVD):瘤組織切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化;0.3% H2O2-甲醇溶液室溫下浸泡后,經(jīng)微波修復(fù)抗原,以 10%山羊血清封閉切片,排除組織和一抗發(fā)生非特異性結(jié)合。按步驟先后滴加 1∶50稀釋的CD34一抗、生物素化二抗和SABC液,用磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對(duì)照;滴加新鮮 DAB顯色液至切片,避光顯色后終止反應(yīng);梯度乙醇逐級(jí)脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,光鏡下觀察并攝影。對(duì)各組裸鼠腫瘤組織CD34染色切片進(jìn)行MVD計(jì)數(shù):染成棕色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞群,只要它們與鄰近微血管、腫瘤細(xì)胞或其它結(jié)締組織分開,就視為一個(gè)微血管,同一個(gè)血管的“頭”和“尾”正好在一個(gè)切面上,也作為兩個(gè)微血管計(jì)算,血管腔和紅細(xì)胞不作為判斷血管的標(biāo)準(zhǔn)。先在100倍視野下觀察整張切片的血管分布情況,確定腫瘤區(qū)域內(nèi)微血管最密集的5個(gè)區(qū)域,即“熱點(diǎn)”。再在200倍光鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域內(nèi)的血管數(shù),取 5個(gè)區(qū)域的平均值,作為該只裸鼠腫瘤的MVD。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用方差分析并行兩兩比較,以 P＜0.05作為具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 Res對(duì)裸鼠移植瘤瘤體大小的影響:在移植瘤生長(zhǎng)的早期階段(前 2周),50mg/kg Res組裸鼠移植瘤瘤體與DMSO組及NS組裸鼠比較并無(wú)明顯差別;2周后移植瘤開始進(jìn)入快速生長(zhǎng)期,開始出現(xiàn)差別,到24d時(shí),50mg/kg Res組處理組裸鼠瘤體明顯小于NS組(P＜0.05);DMSO組與NS組比較前者的瘤體較小,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 Res對(duì)裸鼠移植瘤瘤體大小的影響

2 Res對(duì)裸鼠移植瘤瘤體重量的影響:50mg/kg Res組瘤體重量明顯較 NS組輕,有顯著差異(P＜0.01);0.1%DMSO組及NS組瘤體重量無(wú)明顯差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.51)(圖2)。

圖2 Res對(duì)裸鼠移植瘤瘤體重量的影響

3 Res對(duì) Hep G2細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中 MVD的影響及其與腫瘤體積的相關(guān)性:免疫組化結(jié)果顯示,50mg/kg Res處理組 MVD為18.5±3.2,且呈棕褐色條索狀,微血管分布較稀疏,與生理鹽水對(duì)照組的MVD值(44.2±4.1)相比明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),表明 Res具有抗 Hep G2細(xì)胞裸鼠移植瘤血管生成的作用。經(jīng) Res作用后,裸鼠移植瘤組織中MVD明顯減少的同時(shí)腫瘤體積亦明顯減小,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,移植瘤組織MVD與相對(duì)腫瘤體積呈明顯正相關(guān)(r=0.715,t=4.797,P＜0.01)。

討 論

腫瘤的治療是一個(gè)世界性難題,尋找高效、低毒的抗癌藥物是目前研究的重要課題之一。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有心血管保護(hù)作用,對(duì)多種腫瘤均有抑制作用,可以抑制小鼠皮膚癌[3],人乳腺上皮癌[4],前列腺癌[5]的生長(zhǎng)增殖,能誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞 HL-60細(xì)胞的分化[6]。最近還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可抑制小鼠肺癌(LLC)移植瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移,2.5～10mg/kg的白藜蘆醇可以使腫瘤體積減少 42%,重量減少 44%,肺轉(zhuǎn)移下降56%[7]。前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在體外能抑制Hep G2細(xì)胞的增殖,本研究發(fā)現(xiàn) 50mg/kg Res用藥兩周后,瘤體大小較對(duì)照組為小,顯示出 Res對(duì)裸鼠移植瘤亦有抑制作用;移植瘤裸鼠觀察結(jié)束時(shí)瘤體重量的改變,更加說(shuō)明了Res按 50mg/kg給藥對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)具有較明確的抑制效應(yīng)。這與Res抑制其它腫瘤的研究結(jié)果相似[2]。因?yàn)镽es是疏水性物質(zhì),不易溶于水,因此我們加用了助溶劑 DMSO助溶并作對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn) 0.1%DMSO組與NS組瘤體大小比較差異不明顯,沒有統(tǒng)計(jì)意義。

腫瘤血管生成是指血管內(nèi)皮細(xì)胞從現(xiàn)有的血管系統(tǒng)中分化、遷移而形成新的微血管的復(fù)雜生物學(xué)過程,有多種生長(zhǎng)因子、胞外基質(zhì)成分、蛋白水解酶和細(xì)胞粘附分子參與此過程[8]。惡性腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的主要原因[9],而腫瘤血管生成在其轉(zhuǎn)移的起始及終末階段發(fā)揮著重要作用[10]。血管新生和豐富的血流是腫瘤迅速生長(zhǎng)和發(fā)生轉(zhuǎn)移的病理基礎(chǔ)和重要條件。故如何抑制早期血管生成、破壞腫瘤血管已經(jīng)成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)和突破口。有研究表明,對(duì)腫瘤組織中已經(jīng)存在的血管和/或正在血管生成的腫瘤進(jìn)行干預(yù),阻斷誘導(dǎo)血管生成的通路,能夠有效地抑制腫瘤增殖和生長(zhǎng),使其處于休眠狀態(tài)[11]。近年來(lái)研究表明,血管生成是包括 HCC在內(nèi)的許多實(shí)體瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[12]。目前認(rèn)為腫瘤組織 MVD作為間接測(cè)量腫瘤血管生成的一項(xiàng)指標(biāo),與多種腫瘤臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,以及患者預(yù)后有關(guān)[13]。前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) Res能下調(diào) Hep G2細(xì)胞 VEGF m RNA及蛋白的表達(dá),本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng) Res處理的腫瘤比生理鹽水組腫瘤蒼白,這可能與其抑制了腫瘤血管生成有關(guān)。進(jìn)一步檢測(cè)裸鼠移植瘤組織MVD發(fā)現(xiàn),Res能夠明顯降低裸鼠皮下移植性肝癌組織MVD,且肝癌組織MVD與裸鼠相對(duì)腫瘤體積呈正相關(guān)。這提示Res可以抑制腫瘤組織中的新生血管的形成,降低腫瘤組織MVD,遏制腫瘤生長(zhǎng)。Res可能具有抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

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