磷酸肌酸鈉對小鼠移植性S180肉瘤生長的影響△

河北醫科大學第四醫院腫瘤內科(石家莊 050017)

魏素菊 劉凝華 韓文峰

蒽環類化療藥是腫瘤內科應用最為普遍的藥物之一,但其明顯的心臟毒性往往不僅影響了其臨床規范應用,同時也影響了患者的生活質量。CP是一種廣泛應用于心臟內科及心臟外科的一種心肌保護劑,其作用機制是為機體的高耗能細胞提供能量。但由于腫瘤組織的代謝,該藥物對腫瘤組織的作用尚不明確故其在腫瘤內科的輔助治療中還存在疑慮。本文就通過磷酸肌酸鈉對轉移性小鼠S180肉瘤的PCNA蛋白及Bcl-2和Bax蛋白表達的測定從而研究其對小鼠S180轉移瘤的增殖及凋亡的影響。為該藥物在腫瘤輔助治療中的應用提供實驗依據。

材料與方法

1 主要藥物、試劑與儀器設備 磷酸肌酸鈉購自海口奇力制藥有限公司,為白色粉末,1.0g/支,批準文號:H20053431.PCNA。鼠抗人單克隆抗體及羊抗鼠FITC-Ig G二抗試劑盒均為Sanat Cruz公司產品。DAB顯色試劑:河北博海生物工程有限公司產品,鼠抗人單克隆抗體(BCL-2):北京中杉金橋生物有限公司產品。鼠抗人單克隆抗體(BAX):北京中杉金橋生物有限公司產品。二抗試劑盒:北京中杉金橋生物有限公司產品。

2 細胞株與實驗動物 鼠源性 S180肉瘤細胞株由河北醫科大學第四醫院科研中心提供。昆明種雄性小鼠 60只,清潔動物,3周齡,體重20～22g,購自河北醫科大學實驗動物中心,合格證號:SCXK(冀)2003-1-003。

3 小鼠S180轉移瘤造模 無菌條件下抽取接種7d荷瘤小鼠的腹水,用生理鹽水洗滌 2遍后調整細胞濃度為1×107個/ml,于小鼠右前肢腋下皮下接種,每只 0.2ml。隨機分為生理鹽水對照組及磷酸肌酸鈉低(4mg/d)、中(8mg/d)、高(16mg/d)劑量組。接種次日開始連續腹腔給藥7d,終止治療后觀察1d,各組動物同時全部處死,取出瘤體并稱重后計算抑瘤率并分別保存于70%酒精及液氮中。抑瘤率(%)=(對照組瘤重-給藥組瘤重)/對照組瘤重×100%(公式一)

4 流式細胞儀測定 凋亡率的檢測:75%乙醇固定瘤組織,研磨、過銅網后制成單細胞懸液,調整細胞密度為1×106/ml。取 0.1 ml加入碘化丙啶 4℃冰箱避光染色 30 min,500目銅網過濾后上機檢測凋亡率。

PCNA蛋白的測定:將用 70%冷乙醇固定的腫瘤組織用生理鹽水研磨后制成單細胞懸液,取0.1 ml(細胞密度為1×106/ml),加入0.1 ml 1∶50稀釋的一抗室溫孵育 30min,加入PBS洗滌 1次,棄上清后加入FITC-IgG二抗工作液100μl,避光、室溫孵育30min。加入PBS離心后棄上清,經500目銅網過濾后上機檢測,同時設有PBS代替一抗和二抗的陰性對照。PCNA蛋白表達含量以平均熒光強度(均道值)表示。

均道值=lg(x-Mode)×340(公式二)

5 免疫組織化學檢測小鼠腫瘤組織中 BCL-2和BAX蛋白定性表達

5.1 鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶連接(SP)法染色:10%中性甲醛固定腫瘤組織 4～10 h后,梯度乙醇系列脫水,石蠟包埋后4um連續切片,二甲苯及梯度酒精脫蠟至水,PBS(ph7.4)液浸泡 5min×2,組織抗原微波修復,冷卻,甲醇過氧化氫修復 20min,PBS液泡洗5min×2,擦玻片后置于是濕盒中,血清(A液)封閉,溫箱中孵育 45min,滴加一抗,玻片置于濕盒內冰箱冷藏過夜,PBS液 5min×2,加二抗,入溫箱 30min后,PBS液 5min,加三抗,入溫箱 30min后,PBS液 5min×2,DAB顯色,蘇木精復染,脫水,晾干,中性樹膠封片。用磷酸鹽緩沖液代替一抗,經上述步驟染色,作為陰性對照。

5.2 結果判定:Bcl-2和Bax陽性表達均為細胞胞漿呈棕黃色顆粒狀染色。免疫組化評分標準:在切片中隨機選 5個高倍視野(400倍),循序在 1000個細胞中計數陽性細胞的個數,并由此得出陽性細胞的百分比。表達水平用陽性標記指數(Lableling index,LI)表示[11]。LI(%)=(染色陽性細胞數 /細胞數)×100%(公式三)

結 果

1 各組平均瘤重和抑瘤率,見表1。CP16mg/d組小鼠平均瘤重較對照組減輕,差異有統計學意義(P＜0.05),但是其余各組間平均瘤重差異不顯著(P＞0.05)。CP16mg/d組抑瘤率為11.60%,CP8mg/d組抑瘤率為6.38%,CP 4mg/d組抑瘤率為4.25%。

表1 不同劑量 CP對小鼠 S180移植瘤瘤重的影響(n=15,±s)

表1 不同劑量 CP對小鼠 S180移植瘤瘤重的影響(n=15,±s)

*與對照組相比,P＜0.05

CP 16mg/d組 80mg/ml 0.2ml 2.22±0.30* 11.60%

2 不同劑量 CP對小鼠 S180移植瘤組織中細胞凋亡率的影響:FCM檢測結果顯示 CP16mg/d組細胞凋亡率為13.21±1.15%,高于CP8mg/d組、CP4mg/d組及對照組但各組間差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 不同劑量CP對小鼠S180移植瘤組織中PCNA蛋白表達的影響,見表2。不同濃度CP組 PCNA蛋白的表達均低于對照組,較對照組相比 CP16mg/d組差異有顯著性(P＜0.05),而CP4mg/d和CP8mg/d差異不明顯(P＞0.05)。

表2 不同劑量CP對小鼠 S180移植瘤組織中PCNA蛋白表達的影響(n=15,±s)

表2 不同劑量CP對小鼠 S180移植瘤組織中PCNA蛋白表達的影響(n=15,±s)

*與對照組相比,P＜0.05

CP 16mg/d組 313.39±7.04*

4 免疫組織化學檢測結果:免疫組化結果顯示:Bcl-2和Bax蛋白均以細胞漿呈棕黃色顆粒狀染色的細胞為陽性表達細胞。結果顯示隨著 CP劑量的增加Bcl-2的表達及Bax的均有減弱趨勢。Bcl-2/Bax在CP16mg/d組(0.31±0.11%)最低,CP8mg/d組(0.31±0.09%)、CP4mg/d組(0.32±0.12%)與對照組(0.34±0.13%)比較也呈降低趨勢,但各組間的差異均無顯著性(P＞0.05)。

討 論

隨著新藥物的應用,目前惡性腫瘤的治療前景已有了很大的改觀。但隨之而來的是化療藥物的毒副作用,有時它甚至超過治療本身的作用。磷酸肌酸(Phosphocrentine,Pcr)是參與細胞能量代謝的重要物質之一,在細胞中的含量可達 2～30 mmol/L,它的主要生理功能在于補充體內高耗能細胞內的消耗的ATP,同時 CP能夠抑制細胞膜上5’-核苷酸酶的活性,穩定細胞內腺苷酸含量,從而為細胞內能量代謝創造條件。目前已廣泛應用于各種心臟疾病的治療[1,2]。為了研究 CP應用于化療心臟毒性的預防及治療同時其對腫瘤生長的影響,設計并作了如上實驗,通過流式細胞分析技術檢測小鼠 S180移植瘤組織中 PCNA蛋白的表達及應用免疫組織化學法分析小鼠 S180移植瘤組織中Bcl-2和Bax的表達來研究CP對小鼠S180移植瘤生長的影響。

PCNA是一種 36k D的核蛋白,是 DNA多聚酶的輔助蛋白,存在于細胞核內不同部位,是評價細胞增殖的重要指標。PCNA在細胞的G1晚期表達增加,在 S期達高峰,然后下降[3,4]。檢測其在細胞中的表達,可作為評價細胞增殖狀態的一個指標[5]。本實驗結果顯示,經 CP治療后 PCNA蛋白表達降低,以 CP 16mg/d劑量組為最佳,與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05),而 CP4mg/d和CP8mg/d與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。說明高劑量的CP抑制腫瘤生長與抑制小鼠 S180移植瘤組織中 PCNA蛋白的表達有關。

細胞凋亡的調控是一個十分復雜的多基因作用過程,在這一基因調控網絡中,Bcl-2基因家族起關鍵作用。目前已知Bcl-2家族成員包括:Bcl-2/Bax、Bcl-XL/Bcl-Xs、Bak等,它們相互作用,參與調控細胞的凋亡,其中以 Bcl-2/Bax的作用尤為重要。Bcl-2家族可以分為兩類:一類是抗細胞凋亡基因,代表基因是 Bcl-2基因,其主要生物學功能為延長細胞生命并增強細胞對凋亡刺激因素的抗性;另一類是促細胞凋亡基因,代表基因是 Bax基因,其促進凋亡主要通過拮抗Bcl-2的功能來實現。Bcl-2、Bax均可形成自身同源二聚體或與對方形成異源二聚體,并以二聚體形式參與細胞凋亡的過程。若 Bcl-2同聚體形成則抑制細胞凋亡,而 Bax同聚體形成則誘導細胞凋亡,但當Bcl-2和Bax形成異二聚體復合物時則抑制 Bcl-2的抗凋亡功能。因而認為Bcl-2和Bax之間的比值決定了細胞是否接受誘導凋亡的信號[6～10]。本研究發現 CP給藥組小鼠 S180移植瘤組織中Bcl-2/Bax比值無明顯變化,說明不同濃度的CP對小鼠 S180移植瘤細胞的凋亡無影響。

本實驗通過對 CP治療后小鼠 S180移植瘤的研究發現,治療量的CP不影響小鼠 S180移植瘤的生長,而高劑量的CP可以抑制腫瘤的生長。因此為磷酸肌酸應用于腫瘤的輔助治療提供了實驗依據。

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