黃芪對酒精性肝損傷小鼠 MDA、GSH和TG的影響及肝臟保護作用的研究△

南華大學附屬第一醫院(衡陽 421001)

段 薈 付成效 鄒 瑾*

近年來,酒精性肝病已成為我國僅次于肝炎病毒之后第二大肝病病因。黃芪,含香豆素、黃酮類化合物、皂甙及微量葉酸和數種維生素等。具有補氣固表,托瘡生肌、利水的功效,主治氣血虛弱、自汗、久瀉脫肛、子宮脫垂、肝炎、腎炎浮腫、蛋白尿、糖尿病、慢性潰瘍等癥。近年來臨床運用其保護肝臟日益廣泛。本實驗擬觀察黃芪總提取物對酒精致小鼠急性肝損傷模型 MDA、GSH和TG的影響及肝臟保護作用的影響,為臨床應用提供理論依據。現將實驗方法及結果報告如下。

材料與方法

1 材 料

1.1 藥品:黃芪,南華大學附屬第一醫院藥劑科提供,水提醇沉法濃縮至生藥含量1g/ml。濃縮液滅菌備用;批號:20080815,臨用時取濃縮液用蒸餾水配制為所需濃度。

1.2 動物:雄性昆明種小鼠由長沙市開福區東創實驗動物科技服務部提供,體質量 18～20g,生產許可證號 SCXK(湘)2006-0001。

1.3 試劑與儀器:MDA和GSH試劑盒:南京建成生物工程研究所提供;722分光光度計、OLYMPUS AU400全自動生化分析儀、組織勻漿器等。

2 方 法[1]

2.1 動物分組:雄性昆明種小鼠 50只,稱體質量,隨機分為:空白對照組、模型對照組和黃芪提取物低、中、高劑量組(以下簡稱低、中、高劑量組)。每組 10只。

2.2 劑量選擇與受試物給予方式:設黃芪提取物三個劑量分別為0.5g/(kg· bw)、1.5g/(kg· bw)、4.5g/(kg· bw)(分別相當于成人日服 30g劑量的1、3、9倍),受試液配制時分別取黃芪濃縮液 5ml、15ml、45ml加蒸餾水至200ml,給小鼠按 0.2ml/(10g· bw)體積灌胃。同時設空白對照組和乙醇肝損傷模型對照組,灌胃給予等體積蒸餾水。

2.3 動物處理:各劑量組按 1∶3灌胃給予受試液,空白對照組、模型對照組灌胃給予植物油,1次 /d,連續 30d。第 30天各劑量組和模型對照組灌胃給予50%乙醇 [12ml/(kg· bw)],造成急性肝損傷模型,空白對照組灌胃給予等體積蒸餾水,禁食 16h處死動物,進行各項指標檢測及病理組織學檢查。

2.4 指標檢測:取肝臟用生理鹽水制成10%的肝勻漿,檢測肝組織中還原型谷胱甘肽(GSH)和甘油三酯(TG)的含量。另取肝臟用0.2M磷酸鹽緩沖液制成5%肝勻漿,檢測肝組織中丙二醛(MDA)含量。肝組織內還原型 GSH、MDA含量按南京建成生物工程研究所提供的測試盒說明書進行,肝組織內 TG含量用OLYMPUS AU400全自動生化分析儀測定。

2.5 病理組織學檢查:從小鼠肝左葉中部做橫切面取材,冰凍切片,蘇丹Ⅲ染色。鏡檢時從肝臟的一端視野開始記錄細胞的病理變化,用40倍物鏡連續觀察整個組織切片,觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積,并按以下標準進行評分:0分:肝細胞內脂滴散在、稀少;1分:含脂滴的肝細胞不超過1/4;2分:含脂滴的肝細胞不超過 1/2;3分:含脂滴的肝細胞不超過 3/4;4分:肝組織幾乎被脂滴代替。

2.6 統計學分析:采用SPSS11.0軟件進行分析。

結 果

1 黃芪提取物對小鼠肝臟勻漿 MDA和還原型GSH的影響,見表1。方差齊性檢驗顯示肝組織內MDA、還原型 GSH含量方差齊,采用單因素方差分析,結果顯示,各組總體比較有差異具有統計學意義(P＜0.05),空白對照組、各劑量組與模型對照組均數間肝MDA、還原型 GSH含量的兩兩比較,發現模型對照組小鼠肝 MDA含量顯著高于空白對照組,還原型GSH顯著低于空白對照組,差異均具有統計學意義(P＜0.01),提示酒精性肝損傷模型成立。中、高劑量組小鼠肝MDA含量顯著低于模型對照組,還原型 GSH含量顯著高于模型對照組,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。低劑量組與模型組MDA和還原型GSH含量差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 黃芪提取物對小鼠肝臟勻漿 MDA、GSH含量的影響(n=10,μmol/g肝)[2]

2 黃芪提取物對小鼠肝臟勻漿 TG的影響,見表2。方差齊性檢驗顯示肝組織內 TG含量方差齊,采用單因素方差分析,結果顯示,各組總體比較有差異具有統計學意義(P＜0.05),空白對照組、各劑量組與模型對照組均數間肝 GH含量的兩兩比較,發現模型對照組小鼠肝 TG含量顯著高于空白對照組,差異具有統計學意義(P＜0.01),提示酒精性肝損傷模型成立。高劑量組小鼠肝 TG含量顯著低于模型對照組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。低、中劑量組與模型組 TG含量差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 黃芪提取物對小鼠肝臟組織脂肪改變程度的影響,見表2。方差齊性檢驗顯示肝組織病變程度平均積分方差齊,采用單因素方差分析,結果顯示各組總體比較有差異具有統計學意義(P＜0.05),模型對照組小鼠組織脂變程度顯著重于空白對照組,差異具有統計學意義(P＜0.01),提示酒精性肝損傷模型成立。高劑量組小鼠肝脂變程度較模型對照組顯著減輕,差異具有統計學意義(P＜0.05)。低、中劑量組與模型組肝脂變程度比較有降低趨勢,但是差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 黃芪提取物對小鼠肝臟勻漿 TG含量和肝臟組織脂肪改變程度的影響(n=10)

討 論

小鼠大量攝入乙醇后,在乙醇脫氫酶的催化下大量脫氫氧化,使三羧循環障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝,致使脂肪在肝細胞內沉積。同時乙醇能激活氧分子,產生氧自由基導致肝細胞膜的脂質過氧化及體內還原型谷胱甘肽的耗竭。

小鼠在 30d喂飼黃芪總提取物后,乙醇灌胃造模,模型組各項指標與空白對照組比較,差異均具有統計學意義(P＜0.01),提示造模成功。中、高劑量組可顯著升高肝勻漿中肝損傷引起的GSH降低,提示黃芪提取物可通過增強機體 GSH系統而起到對肝損傷細胞的保護作用。MDA是脂質過氧化反應過程中不飽和脂肪酸氧化分解釋放出的反應性醛,是脂質過氧化反應的終產物,可嚴重破壞細胞膜結構,致細胞腫脹、壞死,其含量的高低可反映肝損傷的程度[3]。中、高劑量組可顯著降低肝勻漿中肝損傷引起的MDA異常升高,提示黃芪提取物同時可通過抑制自由基和脂質過氧化物的產生,而起到對肝損傷細胞的保護作用。高劑量組TG含量顯著低于模型組,提示黃芪還可以通過降低TG含量來保護肝臟。同時病理學檢查結果顯示,高劑量組肝組織病變程度顯著低于模型對照組。綜合以上實驗結果,證實黃芪提取物對酒精性肝損傷小鼠模型有顯著的保護作用。

黃芪是中醫臨床常用藥物,前期對黃芪展開了許多的研究。許多研究證實,黃芪能顯著提高腦、肝組織SOD活性并降低肝臟 MDA含量,能降低缺血再灌法大鼠腎MDA含量及血肌酐濃度,還能提高免疫功能低下小鼠NK細胞活性[4]。焦柏忠等報道了由黃芪、熊膽粉等中藥組成的肝脾膠囊,能顯著降低 CCl4所致的小鼠血清谷丙轉氨酶的升高,降低小鼠肝臟甘油三酯含量,提高肝糖原含量,對肝硬化模型大鼠,能降低肝硬化形成率,降低肝膠原蛋白,血清球蛋白、肝臟羥脯氨酸和肝總脂量,減輕肝臟病理變化。能增加尿素蛋白和銅藍蛋白合成,增加膽汁流量[5]。黃芪的主要成分復雜,其中黃芪多糖顯著降低了血漿、腦勻漿及肝勻漿中過氧化脂質(LPO)水平。并顯著降低了TG、TC水平,升高了HDL-C和SOD水平[6]。下一步應積極開展對黃芪各主要成分的藥理作用的研究,有利深化對黃芪既往功效的認識,發現其新的藥理作用,造福人類社會。

[1] 衛生部衛生法制與監督司.保健食品檢驗與評價技術規范[S].北京:中華人民共和國衛生部,2003:135-139.

[2] 武新華,馬 琪.復方丹參對實驗性急性腦缺血大鼠肝臟損傷的干預作用 [J].陜西醫學雜志,2006,35(2):220-223.

[3] Koruk M,Taysi S,Savas M C,etal.xidative stress and enzymatic antioxidant status in patients with nonalcoholic steatohepatitis.Acta Clin Iab Sci,2004,34:57-62.

[4] 金若敏,張曉晨,陳長勛,等.黃芪毛狀根藥理作用的研究[J].中國中藥雜志,1999,24(10):619-621.

[5] 焦柏忠,劉曉晶,呂美麗,等.肝脾康膠囊藥理作用研究[J].中草藥,1999,30(12):926-929.

[6] 凌洪鋒,蘇 丹,曹 洋,等.黃芪多糖抗氧化作用研究[J].醫學理論與實踐,2005,18(8):872-874.