急性血糖波動對心肌細胞核因子κB及其抑制因子IκB表達的影響△

中國醫科大學盛京醫院內分泌科(沈陽 110004)

趙 晟 張 微 李 艷 韓 萍*

糖尿病心肌病變(DM)是由糖尿病高血糖狀態所導致的一種心臟疾病[1]。氧化應激是所有糖尿病并發癥損害發生的主要因素[2],有證據顯示急性的血糖波動可以導致機體內氧化應激的產生[3]。本研究采用給Wistar雄性大鼠間斷或持續地靜脈輸注50%葡萄糖溶液建立急性血糖波動或持續性動物模型,探討血糖波動誘導的氧化應激反應對心肌細胞的影響。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物:選取7周健康雄性Wistar大鼠18只,體重250～280g,由中國醫科大學實驗動物中心提供,清潔度Ⅰ級,隨機被分為3組,分別為對照組、血糖波動組、持續高血糖組,常規飼料自由飲水,溫度 22±1℃,濕度 50%左右,明 /暗周期為12h。

1.2 主要試劑:兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體、兔抗大鼠 IκB多克隆抗體免疫組化 SABC染色試劑盒,均購自武漢博士德公司。血清MAD、SOD檢測試劑盒,購自南京建成生物工程研究所。

2 實驗方法

2.1 建立血糖波動動物模型:大鼠適應實驗室環境 3～5d后,將導管分別植入右頸內靜脈用于輸液和左頸動脈用于采血。術后3d,進行輸液。分別予對照組 0.9%生理鹽水,使血糖維持在 5mmol/L左右;予血糖波動組 50%葡萄糖注射液間斷輸注,使血糖在5mmol/L與20mmol/L之間波動,每 2h變動血糖值,持續2h,見表1。予持續高血糖組50%葡萄糖注射液持續輸注,使血糖維持在20mmol/L左右。每小時檢測血糖,所有實驗大鼠輸液時間在48h。

2.2 標本采集:輸注相應液體 48h后,取血 5ml,3000轉 /分離心 15min,取上清于-70℃保存備用。摘取左心室心肌,置于4%含 0.1%DEPC的多聚甲醛中固定。

2.3 指標檢測:①血清指標:用比色法法測定血清MDA、SOD;血糖測定采用葡萄糖氧化酶法測定血糖(BIOSEN5030,德國)。②觀察心肌細胞內 NF-κB及IκB表達:用免疫組化的方法測定心肌細胞內 NF-κB、IκB。

2.4 結果判定:利用 Axioplan 2 imaging顯微圖像分析系統測定 NF-κB、IκB陽性著色面積(%)和平均吸光度,以陽性著色面積×平均吸光度計算NF-κB在細胞核中的相對表達量,IκB在細胞質中的相對表達量。

結 果

1 對照組、血糖波動組、持續性高血糖組血糖測定值,見表1,表2。

表1 血糖波動組高峰平臺期血糖值與對照組、持續性高血糖組同時相血糖值的比較(±s)

表1 血糖波動組高峰平臺期血糖值與對照組、持續性高血糖組同時相血糖值的比較(±s)

持續高血糖組 20.1±14 21.5±4.1 21.3±0.2 19.6±1.6 20.1±1.0 21.7±2.3 19.9±0.3 19.4±1.6 20.7±3.2 19.7±1.6 21.9±2.0 20.7±3.0

表2 血糖波動組低谷平臺期血糖值與對照組、持續性高血糖組同時相血糖值的比較(±s)

表2 血糖波動組低谷平臺期血糖值與對照組、持續性高血糖組同時相血糖值的比較(±s)

血糖波動組 5.6±0.3 5.0±4..3 6.3.±1.4 4.7±2.0 4.9±1.9 5.7±4.4 4.9±0.7 5.4±3.1 4.2±0.7 5.7±3.2 6.0±2.0 4.7±3.6持續高血糖組 19.6±3.0 20.1±5.9 21.5±1.2 18.4±4.6 22.1±5.12 0.7±3.2 18.7±1.3 23.5±5.6 20.2±4.8 20.1±3.6 18.0±7.0 22.9±1.0

2 血清 MDA、SOD表達水平,見表3。血糖波動組及持續性高血糖組血清中 MDA、SOD表達水平明顯高于對照組(P＜0.05),而且血糖波動組血清中 MDA、MDA/SOD比值均高于持續性高血糖組(P＜0.01);血糖波動組MDA/SOD比值顯著高于對照組及持續性高血糖組(P＜0.01),持續性高血糖組 MDA/SOD比值高于對照組但是無統計學差異(P＞0.05)。

表3 對照組、血糖波動組及持續性高血糖組血清 MDA(nmol/ml)、SOD(U/ml)水平

血糖波動組、持續性高血糖組心肌細胞核內 NF-κB、IκB的表達明顯高于對照組(P＜0.05),血糖波動組與持續性高血糖組無統計學差異(P＞0.05);血糖波動組、持續性高血糖組心肌細胞的NF-κB/IκB明顯高于對照組(P＜0.05),血糖波動組心肌細胞內表達的NF-κB/IκB比值低于持續性高血糖組,但是無統計學差異(P＞0.05)。

3 心肌細胞內 NF-κB、IκB及NF-κB/IκB比值表達,見表4。

表4 對照組、血糖波動組及持續性高血糖組血清MDA、SOD水平

討 論

NF-κB是一種具有多向性的轉錄因子,能被多種物質刺激激活。NF-κB蛋白 N-末端具有 Rel蛋白同源結構域(Rel homology domain,RHD),該結構域是NF-κB二聚化的活性位點、與定位細胞核 DNA結合位點和IκB相互作用位點,蛋白 C末端擁有 IκB特征性結構域-錨蛋白重復序列[3,4]。當細胞未受到外界刺激時,IκB與NF-κB結合形成復合體,存在于細胞質內;當細胞受到外界刺激時如細胞因子等,細胞質中的IκB激酶(IκB kinase,IKK)發生積聚并被激活,活化的IKK能使 IκB磷酸化,之后 IκB與NF-κB分離,并被降解,同時NF-κB被激活,而進入細胞核促進炎癥因子如細胞間粘附因子(Intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)等基因轉錄表達。

本研究對 Wistar大鼠心肌細胞的研究過程中,發現血糖波動組及持續性高血糖組的心肌細胞核NF-κB表達明顯高于對照組(P＜0.05)。此外,發現血糖波動組及持續性高血糖組大鼠血清中MDA、MDA/SOD的水平顯著高于對照組(P＜0.05),而血糖波動組表達又顯著高于持續性高血糖組(P＜0.01),反映血糖波動和持續性高血糖都能誘導機體出現強烈的氧化應激反應,而且血糖波動誘導機體氧化應激的作用更強。血糖波動和持續性高血糖通過誘導實驗雄性Wistar大鼠體內氧化應激反應增強,激活心肌細胞內NF-κB,從而入核表達。Osorio-Fuentealba C等[5,6]在缺氧的心肌細胞中發現活性氧簇(Reactive oxidative species,ROS)明顯升高,ROS激活了NF-κB,啟動介導的細胞信號轉導通路。

NF-κB作為典型的多向性轉錄因子,在許多的免疫應答反映的信號途徑中發揮關鍵性作用。NF-κB能被多種刺激如細胞因子等激活,活化的NF-κB介導多種促炎癥的細胞因子和粘附分子的表達和合成[7]。心肌細胞內 NF-κB細胞信號轉導通路的功能非常復雜,除促進促炎癥的細胞因子的表達外,NF-κB還能激活其他多種基因的表達,繼而影響心肌細胞的生長、收縮、死亡及細胞外基質重塑等病理生理過程[8]。

近年來研究顯示,NF-κB活化導致細胞內誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric-oxide synthase,iNOS)表達,促進細胞內氧化應激反應增加作用[9]。而大量ROS的蓄積可激活 JNK介導的線粒體依賴性細胞凋亡信號途徑,從而誘導細胞發生凋亡[10～12]。糖尿病心肌細胞存在明顯的凋亡現象,而影響凋亡的原因之一就是高糖。本研究發現血糖波動能導致機體 ROS增多及心肌細胞內 NF-κB激活,后者激活可導致炎癥因子進一步表達,可能是糖尿病時血糖波動導致心肌細胞損害的主要病理生理機制之一。

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