一氧化氮在順鉑耳、腎毒性中的作用△

河北醫科大學第二醫院麻醉科(石家莊 050000)

戚 翔 劉硯星* 路 虹# 張惠軍 王 娜* 連易水*

順氯胺鉑(Cis-platium diamminedichloride,DDP或 PDD)是鉑的無機螯合物,簡稱順鉑(Cis platin),主要用于治療泌尿生殖系的膀胱、睪丸、卵巢等處的惡性腫瘤及頭頸部癌。其主要的毒副作用有消化道反應、內耳中毒、腎臟損害及骨髓抑制,其中以內耳中毒和腎臟損害最為嚴重。

一氧化氮(Nitric oxide,NO)是 L-精氨酸在一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)的催化下生成的。NOS分為兩種亞型:結構型(cNOS)和誘導型(iNOS),前者催化生成的NO量少,主要在生理情況下起作用,例如介導內皮細胞舒張和傳導神經信息。而iNOS催化下生成的NO量多,主要在病理條件下起作用,造成組織細胞的損害[1～4]。NO的病理損傷作用可能是因為它能和氧自由基反應,生成氮的過氧化物,后者的氧化性很強,通過阻滯線粒體的呼吸等作用,發揮其細胞毒性。

本研究通過建立順鉑中毒的動物模型,應用免疫組織化學的研究方法觀察內耳及腎臟中iNOS表達活性的改變,探討順鉑的耳毒性、腎毒性的機制,為臨床工作中預防和治療其毒副作用提供理論依據。

材料與方法

1 材料選擇 選擇成熟健康、耳廓反應靈敏的白毛紅目豚鼠 20只,體重為350～450g,雌雄不限,隨機平均分為兩組,分別為實驗組和對照組。

2 方 法 實驗組的豚鼠連續 5d腹腔注射順2mg/(kg· d),用生理鹽水稀釋成 0.5ml;而對照組的豚鼠連續 5 d腹腔注射生理鹽水 0.5 ml/(kg· d)。

實驗過程中嚴密觀察豚鼠的一般情況變化,對照組與實驗組于第 6天,以斷頭法處死動物,快速取出聽泡,暴露耳蝸,將其浸于4% 多聚甲醛中固定,并在解剖顯微鏡下取出鐙骨,挑破卵圓窗、圓窗,蝸頂鉆孔,用吸管以固定液緩慢灌流耳蝸,每個標本灌流5遍。同時快速取出腎臟,浸于4% 多聚甲醛中。次日取出耳蝸標本,以0.01 M PBS液清洗,置于10%EDTA中脫鈣10 d,PBS液清洗,石蠟包埋,平行蝸軸切片,一部分切片HE染色,另一部分脫蠟至水,按順序滴加復合消化液、正常山羊血清封閉液、一抗(兔抗鼠iNOS的抗體)、二抗(生物素化山羊抗兔 IgG)、SABC(鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物),DAB顯色。蒸餾水洗滌,蘇木素輕度復染。脫水,透明,封片,顯微鏡觀察。腎臟標本亦于次日取出,PBS液清洗,石蠟包埋,切片,行免疫組化流程處理(同耳蝸標本)。

結 果

對照組豚鼠在給藥前后,無異常表現。實驗組動物在給藥期間均出現活動減少,食欲減退,毛發疏松脫落,體重減輕,耳廓反應遲鈍。

對照組的耳蝸各轉螺旋器的細胞結構正常,iNOS免疫組化示,內、外毛細胞的胞漿中未見棕黃色顆粒,呈陰性染色(圖1)。實驗組的耳蝸螺旋器中,外毛細胞明顯變性,輪廓不清,細胞核融合消失;內毛細胞呈退行性變。支持細胞輕度變性。各轉耳蝸螺旋器的外毛細胞和內毛細胞的胞漿中可見棕黃色顆粒,呈iNOS免疫組化陽性染色(圖2,3)。支持細胞的染色不一致,蓋膜非特異性著色。

對照組的腎臟的皮質、髓質細胞結構正常,腎小球、近曲小管、遠曲小管及間質的細胞胞漿中均未見棕黃色顆粒,呈iNOS免疫組化陰性染色(圖4,5)。實驗組的腎臟皮質的近曲小管上皮細胞的胞漿中可見棕黃色顆粒,髓質的遠曲小管上皮細胞的胞漿中可見棕黃色顆粒,呈免疫組化陽性染色(圖6),腎小球及間質的細胞胞漿中未見棕黃色顆粒。

圖1 對照組耳蝸螺旋器呈陰性染色(×400)

圖2,3 實驗組耳蝸螺旋器呈陽性染色(×400)

圖4,5 對照組腎小球、腎小管呈陰性染色(×200)

圖6,7 實驗組腎近曲小管、遠曲小管上皮細胞呈陽性染色(×400)

討 論

豚鼠耳蝸螺旋器的免疫組化顯示,對照組的螺旋器呈iNOS陰性染色,而實驗組的螺旋器,內毛細胞和外毛細胞呈iNOS陽性染色。豚鼠腎臟的免疫組化顯示,對照組的皮質、髓質各細胞呈iNOS陰性染色,而實驗組的腎臟,近曲小管、遠曲小管的上皮細胞呈iNOS陽性染色。以往研究表明,在生理情況下,內耳和腎臟的iNOS不表現生物活性,NO的量少,主要發揮其生理調節作用,如通過影響內耳血管紋和外毛細胞來改變聽覺生物電和外毛細胞的機械特性[5]。而順鉑作用于機體后,耳蝸內的iNOS被激活,被激活的iNOS催化L-精氨酸生成大量的NO,而過量的NO會產生病理性損傷作用,造成內耳螺旋器上的內毛細胞、外毛細胞及腎臟的近曲、遠曲小管的上皮細胞的損害,從而影響耳蝸的感音功能和腎小管的重吸收及排泌功能。NO造成組織細胞損害的具體機制如下:NO為不穩定氣體,遇超氧陰離子(O2-)反應生成過氧亞硝基陰離子(ONOO-),ONOO-很容易分解成羥基自由基(·OH)和二氧化氮(NO2),ONOO-,· OH和NO2的氧化性質都很強,具有很大的細胞毒性,可造成細胞膜、線粒體,蛋白質、核酸、酶類的損傷[6]。NO的另一生物毒性作用是從三個不同環節來干擾細胞的能量代謝:抑制三磷酸甘油醛脫氫酶的活性,影響復合物Ⅰ、Ⅱ的形成,抑制氧化磷酸化[7,8]。此外,可與細胞 DNA發生硝基化反應,造成DNA的損傷[9]。

研究結果顯示,NO在順鉑耳毒性、腎毒性的作用中占有重要的地位:順鉑通過激活iNOS引起NO的過量生成,NO與超氧陰離子反應,生成有強氧化性的分子,后者損傷耳蝸及腎臟的超微結構,從而影響內、外毛細胞及腎小管上皮細胞的代謝和功能,這可能是順鉑造成耳毒性、腎毒性的重要途徑之一。根據此項研究,臨床醫生可以考慮應用 NOS的競爭性拮抗劑(如L-NAME,L-NNA,L-NMMA)來預防、治療順鉑所造成的耳蝸及腎臟的超微結構的損傷。

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