高效液相色譜法測定通經(jīng)甘露丸中大黃酸、大黃素及大黃酚含量

吳 襲

(湖南省懷化市第一人民醫(yī)院，湖南 懷化 418000)

通經(jīng)甘露丸收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第一冊)》，是由當(dāng)歸、桃仁、紅花、牡丹皮、牛膝、大黃等10味中藥制成的水丸，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛功效，用于血瘀阻滯所致經(jīng)閉不通、小腹疼痛，或經(jīng)量少、小腹疼痛拒按。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無含量測定項，為有效控制藥品質(zhì)量，確保療效，筆者參考文獻(xiàn)[1]，采用高效液相色譜法測定其大黃中大黃酸、大黃素及大黃酚含量。

1 儀器與試藥

LC-10ATVP型高效液相色譜儀，SPD-10AVP紫外檢測器(日本島津);AB135-S型電子天平(瑞士梅特勒);AEU-210型電子天平(湘儀集團(tuán))。大黃酸、大黃素及大黃酚對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供(批號分別為0757-200206，0756-200110及0756-200329);通經(jīng)甘露丸(吉林省柳河輝發(fā)制藥股份有限公司，批號分別為 20080301，20071101，20080615，規(guī)格為 6 g/100 粒);甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇-0.1%磷酸溶液(85 ∶15);流速:1.0 mL/min;檢測波長:254 nm。在此色譜條件下，大黃酸、大黃素、大黃酚色譜峰與樣品中其他組分峰能達(dá)基線分離，且與其他相鄰峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按大黃素峰計應(yīng)不低于7 000，缺大黃的陰性對照品溶液色譜在與大黃酸、大黃素及大黃酚對照品溶液色譜峰相應(yīng)位置上無干擾峰(圖1)。

2.2 溶液制備[2]

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥16 h的對照品大黃酸7.70 mg、大黃素4.80 mg及大黃酚7.76 mg，分別置100 mL量瓶中，用乙酸乙酯-無水乙醇(1∶2)混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取大黃酸對照品貯備液2 mL、大黃素對照品貯備液2 mL及大黃酚對照品貯備液3 mL，置同一10 mL量瓶中，加上述混合溶液至刻度，搖勻，制成1 mL中含大黃酸 15.40μg，大黃素9.60μg，大黃酚 23.28μg的混合對照品溶液。取本品適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，冷卻，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取5 mL，置錐形瓶中，蒸干，殘渣加鹽酸溶液(1→10)10 mL，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)5 min，再加三氯甲烷10 mL，置水浴上加熱回流1 h，立即冷卻，移至分液漏斗中，分取三氯甲烷液，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷液至干，殘渣用乙酸乙酯-無水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，溶液轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。取缺大黃的陰性樣品適量，照供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密吸取上述混合對照品溶液6，8，10，12，14，16μL，進(jìn)樣測定其峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程分別為大黃酸 Y=1 479 587 X+1 239，r=0.999 8(n=6);大黃素 Y=2 589 583X-7.3，r=0.999 9(n=6);大黃酚 Y=3 892 899X+58.5，r=0.999 8(n=6)。結(jié)果表明，大黃酸進(jìn)樣量在0.092 4～0.2464μg，大黃素進(jìn)樣量在0.0576～0.153 6μg，大黃酚進(jìn)樣量在0.139 7～0.372 5μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定大黃酸、大黃素及大黃酚峰面積積分值，結(jié)果的 RSD分別為1.02%，1.25%，0.64%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，于0，2，4，8，10 h時分別進(jìn)樣1次，依法測定大黃酸、大黃素及大黃酚的峰面積積分值。結(jié)果的RSD分別為0.98%，1.10%，1.03%(n=5)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)較穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同一批(批號為20080301)樣品，分別取樣5份，依法測定大黃酸、大黃素及大黃酚的含量。結(jié)果的 RSD分別為1.18%，0.83%，1.07%(n=5)，表明本法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗:取已知含量(每克含大黃酸0.655 7 mg，大黃素0.327 5 mg，大黃酚 1.265 2 mg)的樣品，研細(xì)，取約 0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，冷卻，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取5 mL，精密加入混合對照品溶液(大黃酸0.065 4 g/L，大黃素0.033 8 g/L，大黃酚 0.120 1 g/L)0.8，1.0，1.2 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液，并測定其含量，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗測定結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取樣品3批，按供試品溶液制備方法制備供試液并測定峰面積，計算樣品中大黃酸、大黃素及大黃酚的總量。結(jié)果批號為20080301，20071101，20080615的3批樣品中，大黃酸、大黃素及大黃酚的含量分別為 1.248 4，1.199 6，1.305 7 mg/g。

3 討論

經(jīng)紫外-可見分光光度計掃描，大黃酸、大黃素和大黃酚在254 nm波長處有最大吸收，且靈敏度高，故選254 nm作為檢測波長[3]。曾比較了三氯甲烷和乙醚的提取效果，結(jié)果三氯甲烷提取的大黃酸、大黃素和大黃酚含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乙醚，故用三氯甲烷作為提取溶劑[3]。提取2次和提取3次對含量無明顯影響，故決定提取2次。所建立的高效液相色譜法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，且樣品分離效果好，用于通經(jīng)甘露丸中大黃酸、大黃素和大黃酚的含量測定，能有效控制通經(jīng)甘露丸的質(zhì)量。

[1]WS3-B-0121-89，中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第一冊)[S].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:373，649.

[3]劉 譯.RP-HPLC法測定牛黃至寶丸中大黃素和大黃酚的含量研究[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，13(8):83-84.