巴戟天藥材高效液相色譜指紋圖譜初步研究*

程學(xué)仁，羅文匯，孫冬梅，崔景朝

(廣東省中醫(yī)研究所，廣東 廣州 510095)

2005年版《中國(guó)藥典(一部)》中收載的巴戟天為茜草科植物巴戟天 Morinda officinalis How的干燥根。近代巴戟天的主流商品產(chǎn)于廣東的高要、德興及廣西蒼梧等地，《藥物出產(chǎn)辨》中謂產(chǎn)于以上地區(qū)的巴戟天可視為晚近藥用巴戟天的“新興品種”[1]。近幾年，指紋圖譜技術(shù)被用于中藥的質(zhì)量控制，其優(yōu)點(diǎn)是在大多數(shù)中藥有效成分尚不明確的情況下，能全面反映中藥復(fù)雜的化學(xué)成分和相對(duì)比例，有效地表征中藥質(zhì)量。筆者按照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局《關(guān)于“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)”的通知》要求[2]，參照相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]，采用高效液相色譜法對(duì)巴戟天藥材進(jìn)行了指紋圖譜研究，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)惠普公司);二極管陣列檢測(cè)器;電子分析天平(Sartorius)。巴戟天對(duì)照藥材(編號(hào)為S1，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為121163-200402);巴戟天藥材采自中國(guó)廣東、廣西、江西等地和越南，經(jīng)本所范宋玲主任中藥師鑒定為茜草科植物巴戟天 Morinda officinalis How，藥用部分為根，樣品來(lái)源詳見(jiàn)表1。液相用甲醇為進(jìn)口色譜純，水為注射用水;提取用水為反滲透水;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 巴戟天藥材來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，0～5 min甲醇50%，5～17 min甲醇 50% ～58%，35～55 min，甲醇 58% ～80%;柱溫:40℃;流速:0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm。

2.2 溶液制備

取巴戟天藥材約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷60 mL，回流3 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⒍ㄈ葜? mL，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，搖勻，即得供試品溶液。取巴戟天對(duì)照藥材約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷60 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn):取對(duì)照藥材溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜指紋圖譜。計(jì)算得圖譜的相似度均大于0.98，各共有峰面積的 RSD小于0.60%，結(jié)果表明進(jìn)樣的精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取4號(hào)樣品，按2.2項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定色譜指紋圖譜。計(jì)算得圖譜的相似度均大于0.97，各共有峰面積的 RSD小于0.75%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取4號(hào)樣品制備的供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定色譜指紋圖譜。計(jì)算得圖譜的相似度均大于0.96，各共有峰面積的 RSD小于1.43%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 HPLC指紋圖譜分析與評(píng)價(jià)

圖譜制備:詳細(xì)比較10批巴戟天藥材的液相色譜圖，確定12個(gè)特征峰構(gòu)成巴戟天的指紋圖譜，各特征峰峰號(hào)及保留時(shí)間見(jiàn)表2。代表性指紋圖譜見(jiàn)圖1。

表2 10批巴戟天藥材指紋圖譜共有峰及保留時(shí)間

圖1 巴戟天藥材指紋圖譜共有峰

共有峰相似性評(píng)價(jià):根據(jù)巴戟天藥材的高效液相色譜指紋圖譜確定共有峰23個(gè)，并對(duì)共有峰的相對(duì)峰面積比值進(jìn)行考察。由于HPLC峰的絕對(duì)遷移時(shí)間變化較大，所以采用相對(duì)遷移時(shí)間對(duì)色譜峰進(jìn)行鑒別。經(jīng)多次試驗(yàn)，選擇5號(hào)峰作為參比內(nèi)標(biāo)較為合適。相對(duì)遷移時(shí)間 αi=ti/ts，ti為樣品峰的遷移時(shí)間，ts為內(nèi)標(biāo)峰的遷移時(shí)間。相對(duì)遷移時(shí)間 αi從小到大排列，相對(duì)遷移時(shí)間 αi下面列出了相對(duì)峰面積 βi。相對(duì)峰面積 βi=Ai/As，Ai為樣品峰面積，As內(nèi)標(biāo)峰面積。結(jié)果見(jiàn)表3。可見(jiàn)，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的 RSD小于1.94%;10批樣共有峰總面積占總峰面積的94.38%，非共有峰總面積均小于總峰面積的10%。

指紋圖譜相似度計(jì)算:采用《中國(guó)藥典》指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(A版)，對(duì)10批巴戟天藥材進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。將10批藥材指紋圖譜導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)軟件，設(shè)定匹配模板，進(jìn)行譜峰自動(dòng)匹配，生成對(duì)照指紋圖譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。由表4可見(jiàn)，藥材與對(duì)照藥材圖譜的相似度(以平均數(shù)計(jì)算和以中位數(shù)計(jì)算)均大于0.9，表明10批藥材與對(duì)照藥材指紋圖譜相似度良好。

表3 巴戟天藥材高效液相色譜指紋圖譜的共有峰相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)峰面積(βi，n=4)

表4 10批巴戟天藥材相似度計(jì)算結(jié)果

3 討論

采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)巴戟天的最佳提取條件進(jìn)行篩選，其中對(duì)提取溶劑(甲醇、乙醇、乙酸乙酯和三氯甲烷)、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察，采用HPLC進(jìn)行測(cè)定，在綜合考慮峰面積較大、峰個(gè)數(shù)較多等幾個(gè)方面的因素后，確定2.2項(xiàng)中的提取條件為最佳提取條件。采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行選擇，比較了不同波長(zhǎng)下的色譜圖，基于峰面積較大、峰個(gè)數(shù)較多、分離度較好、峰形較好、基線較平穩(wěn)等多方面的考慮，最后選擇250nm作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。對(duì)巴戟天供試品溶液進(jìn)行了甲醇-水和乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)考察，經(jīng)過(guò)分離效果的反復(fù)摸索，發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)基線較乙腈-水系統(tǒng)平直，流動(dòng)相中加入磷酸后改善了色譜峰的峰形和分離度。本研究建立的巴戟天藥材指紋圖譜方法具有很好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，相似度計(jì)算在宏觀上能總體反映出巴戟天的化學(xué)特征，為規(guī)范巴戟天藥材的質(zhì)量提供了依據(jù)。在本研究中，雖然收集了10個(gè)巴戟天藥材，采用HPLC法作為獲得化學(xué)數(shù)據(jù)的手段，進(jìn)行了巴戟天的指紋圖譜研究，但所獲得的信息也只能從一個(gè)側(cè)面反映巴戟天藥材的質(zhì)量。為了獲得更全面的分類信息，使巴戟天藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法更為完善，還需要收集更多的樣品進(jìn)行比較分析。

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