聚乙烯亞胺介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的影響因素研究

周 鵬，張 瑜

(1.廣東省深圳龍珠醫(yī)院，廣東 深圳 518055;2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓科，新疆 烏魯木齊 830001)

基因轉(zhuǎn)染是指利用基因載體攜帶目的基因運送到細胞內(nèi)的方法。目前在基因治療中，由于病毒載體存在著諸多缺陷[1]，非病毒載體如陽離子脂質(zhì)體和陽離子共聚物越來越受到重視[2-3]。其中聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是目前研究較多的聚陽離子型基因載體[4]，富含氨基，可與DNA鏈上負電性的磷酸根通過靜電作用締合成復(fù)合物。在此過程中，DNA會被高度壓縮成50～200 nm大小的納米球[5]，大大增強了對細胞膜的穿透作用，因此具有較高的轉(zhuǎn)染效率[6]。但PEI作為非病毒基因載體，其轉(zhuǎn)染效率的影響因素較多，重復(fù)性不好。筆者考察了影響其轉(zhuǎn)染效率的因素，從而篩選出較優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件，為進一步的研究打下基礎(chǔ)。

1 實驗材料

PEI(相對分子質(zhì)量為25 000，支鏈型，無水，Aldrich-Sigma公司)。人宮頸癌細胞系Hela細胞(ATCCNo.CCL-2.1)，在100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，血清56℃滅活30 min。真核表達質(zhì)粒編碼增強型綠色熒光蛋白(theenhanced green fluorescent protein，pEGFP-C1，華西醫(yī)科大學(xué)惠贈)，由CMV啟動子驅(qū)動，在DH5α菌株中大量擴增。由QIAGEN公司的質(zhì)粒大抽提試劑及純化柱制備質(zhì)粒，酶切鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 PEI/DNA復(fù)合物的制備及其形態(tài)觀察

氮磷比(N/P)為聚合物中的氨基基團與DNA中的磷酸基團的物質(zhì)的量之比。根據(jù)N/P，將聚合物的磷酸鹽緩沖液與質(zhì)粒DNA的磷酸鹽緩沖液混合，渦旋，室溫靜置30 min，獲得聚合物-DNA復(fù)合物。取適量滴加在銅網(wǎng)上，用醋酸鈾進行負染，干燥后置透射電鏡下觀察復(fù)合物膠束的形態(tài)。由圖1可見，各PEI-DNA復(fù)合物納米粒呈規(guī)則的球形，粒子大小分布較均一，表明二者已形成復(fù)合物納米粒。

2.2 質(zhì)粒量對轉(zhuǎn)染效率的影響

圖1 PEI-DNA納米復(fù)合物的透射電鏡圖譜(N/P=20)

將Hela細胞接種到12孔板上，每孔1.5×105個細胞，培養(yǎng)24h，細胞匯合度不低于70%，將PEI與DNA分別在磷酸鹽緩沖液中配成一定濃度的溶液。設(shè)質(zhì)粒劑量分別為每孔 0.5，1，2，3，4 μg，然后將兩者按N/P=10混合，渦旋，室溫靜置20 min。轉(zhuǎn)染前吸去細胞培養(yǎng)液，加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，再每孔加入100～200μL的PEI-DNA復(fù)合物，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入新鮮的含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)40～48 h，然后用磷酸鹽緩沖液沖洗，再用0.25 g/L胰酶-乙二胺四乙酸消化液將細胞消化下來，用磷酸鹽緩沖液重懸細胞，轉(zhuǎn)染率通過在流式細胞儀上測定每10 000個細胞中發(fā)熒光的細胞百分數(shù)獲得。結(jié)果如圖2所示，在12孔板中，當每孔質(zhì)粒量少于2μg時，轉(zhuǎn)染率較低;當質(zhì)粒量達到每孔2μg后，繼續(xù)增加質(zhì)粒量，轉(zhuǎn)染率反而下降。因此12孔板質(zhì)粒的用量以每孔2μg較適宜。

圖2 不同質(zhì)粒量對轉(zhuǎn)染率的影響

2.3 復(fù)合物形成時間對轉(zhuǎn)染效率的影響

將Hela細胞接種到12孔板上，每孔1.5×105個細胞，培養(yǎng)24h，細胞匯合度不低于70%，將PEI與DNA分別在磷酸鹽緩沖液中配成一定濃度的溶液，按轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量為每孔2μg，N/P=10混合，渦旋，室溫靜置 10，20，30，40，50 min。轉(zhuǎn)染前吸去細胞培養(yǎng)液，加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，再每孔加入100～200μL的PEI-DNA復(fù)合物，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入新鮮的含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)40～48 h，收集細胞，轉(zhuǎn)染率通過在流式細胞儀上測定每10 000個細胞中發(fā)熒光的細胞百分數(shù)獲得。復(fù)合物形成時間是PEI上的正電荷與DNA上負電荷相互作用形成球狀納米粒的時間，時間過短不能充分形成球狀納米粒，時間過長納米粒容易沉淀影響轉(zhuǎn)染效率。由圖3可見，復(fù)合物形成時間以30 min為宜。

圖3 復(fù)合物形成時間對轉(zhuǎn)染率的影響

2.4 復(fù)合物與細胞作用時間對轉(zhuǎn)染率的影響

將Hela細胞接種到12孔板上，每孔1.5×105個細胞，培養(yǎng)24 h，細胞匯合度不低于70%，將PEI與DNA分別在磷酸鹽緩沖液中配成一定濃度的溶液，按轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量為每孔2μg，N/P=10混合，室溫靜置30 min，轉(zhuǎn)染前吸去細胞培養(yǎng)液，加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，再每孔加入100～200μL的PEI-DNA復(fù)合物，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3，4，5，6 h后，吸去轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入新鮮的含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)40～48 h，收集細胞，轉(zhuǎn)染率通過在流式細胞儀上測定每10 000個細胞中發(fā)熒光的細胞百分數(shù)獲得。轉(zhuǎn)染復(fù)合物需與細胞作用一定時間，使其與細胞充分接觸，進入細胞內(nèi)，但復(fù)合物作用時間較長時，細胞死亡較多，對轉(zhuǎn)染不利。由圖4可見，轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細胞作用4 h時轉(zhuǎn)染效率較高。

圖4 復(fù)合物在細胞上的作用時間對轉(zhuǎn)染率的影響

2.5 N/P對轉(zhuǎn)染效率的影響

將Hela細胞接種到12孔板上，每孔1.5×105個細胞，培養(yǎng)24 h，細胞匯合度不低于70%，將PEI與DNA分別在磷酸鹽緩沖液中配成一定濃度的溶液，按轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量為每孔2μg，N/P=10，15，20，25，30 混合，室溫靜置 30 min，轉(zhuǎn)染前吸去細胞培養(yǎng)液，加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，再每孔加入100～200μL的PEI-DNA復(fù)合物，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入新鮮的含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)40～48 h，收集細胞，轉(zhuǎn)染率通過在流式細胞儀上測定每10 000個細胞中發(fā)熒光的細胞百分數(shù)獲得。PEI介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染率與N/P比值的關(guān)系極大。筆者考察了N/P為 10，15，20，25，30 時對 PEI轉(zhuǎn)染Hela的影響。如圖5所示，N/P=20時被轉(zhuǎn)染細胞增強型綠色熒光蛋白(EGFP)陽性效率最高。

圖5 不同N/P對轉(zhuǎn)染率的影響

3 討論

PEI是目前研究較為廣泛的聚陽離子基因載體，其每3個基團含有1個氨基，有豐富的陽離子電荷，可縮合DNA呈顆粒狀。PEI-DNA復(fù)合物通過靜電作用吸附到細胞表面[7]，被動內(nèi)吞，進入細胞內(nèi)。制備PEI-DNA復(fù)合物方法簡單，轉(zhuǎn)染效率不亞于各種商業(yè)化的體外轉(zhuǎn)染劑[8]。PEI可作為一種結(jié)合DNA的骨架，偶聯(lián)上導(dǎo)向配體、核定位信號肽等，合成更復(fù)雜的DNA非病毒載體釋放系統(tǒng)，用于體內(nèi)基因治療。但影響PEI轉(zhuǎn)染效率的因素較多，如質(zhì)粒量、復(fù)合物形成時間、轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細胞作用時間、N/P等。其中N/P對轉(zhuǎn)染的影響最大，N/P增加時，陽性細胞比例增加，細胞毒性也增加，根本原因在于PEI的用量增加。本試驗發(fā)現(xiàn)，當N/P較低時，PEI-DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率隨N/P增加而增加，當N/P增加到一定值后，細胞毒性增加明顯，死亡細胞急劇增加，轉(zhuǎn)染效率反而下降。

由本研究結(jié)果可知，PEI介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染Hela細胞較優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件為質(zhì)粒量2μg，復(fù)合物形成時間30 min，復(fù)合物在細胞上作用4 h，N/P=20。此轉(zhuǎn)染條件可為進一步的體內(nèi)研究打下基礎(chǔ)。

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