嵌頓痔患者外周血Th1/Th2檢測分析

1 一般資料與方法

1.1 對象 本組共32例，其中，男18例，女14例，年齡20～60歲。全部為混合痔嵌頓患者。32例均行手術治療，分別于術前、術后2周抽靜脈血5ml肝素鈉抗凝。

1.2 檢測目的 應用流式細胞儀檢測外周靜脈血中細胞表面分子標記為CD3+和CD8-的T淋巴細胞中的IL-4 和IFN-γ含量，從而判斷外周血中的Th1、Th2漂移現象。

1.3 檢測方法 主要儀器：流式細胞儀Epics XL·MCL，美國BECKMAN COULTER公司，低溫高速離心機Contifuge Stratos，德國Heraeus公司，旋渦混合器XW－80A江蘇省海門市麒麟醫用儀器廠。

試劑：PMA、Ionomycin、Monensin美國Sigma公司出品，抗體和破膜劑。以下均為法國Immunotech公司出品：細胞表面標記抗體：CD3-Pc5，CD8-FITC；細胞內因子抗體：IL-4-PE，IFN-γ-PE；同型對照：Rat IgG1-PE(對應于IL-4-PE)，Mouse IgG1-PE(對應于IFN-γ-PE)；破膜劑：IntraPrep破膜劑。

1.4 實驗方法 晨起空腹血5ml用肝素納抗凝。取一只試管，加入200μl血液和200μlRPMI1630。加入10μlPMA工作液＋8μl50μg/ml Ionomycin工作液＋6.8μl 0.1mg/mlMonensin工作液，混勻。置于37℃，5%CO2培養箱4～6小時。取出混勻，加入20μlCD3-PC5和20ulCD8-FITC，室溫避光孵育15分鐘。分成4管，每管加入100μl已染色的全血，編號為A1,A2,A3,A3。每管中加入100μl IntraPrep中的Reagebt A（固定液），室溫，避光孵育15分鐘。每管中再加入3mlPBS，1500rpm離心5分鐘，棄除上清。再每管中加入100μlIntraPrep中的Reagent B（破膜和溶血液），同時各管中按附表1加入相應的抗體各10μl，室溫，避光孵育15分鐘。每管中加入3mlPBS，1500rpm離心5分鐘，棄除上清。取0.5ml PBS重懸細胞，上機檢測。

2 結果

手術前后的外周血單個核細胞經PAM誘導后CD3+/CD8-/IFN-γ+和CD3+/CD8-/IL-4+流式細胞分析結果。見附表。

經Excel平均值的成對雙樣本分析，對各組數據進行兩兩檢驗。手術前與手術后各組數據比較均有非常顯著性差異（P＜0.001），手術前組患者的CD3+IL-4+含量高于手術前組的CD3+IFN-γ+（P＜0.05），手術前組患者的CD8+IL-4+含量也高于手術前組的CD8+IFN-γ+（P＜0.05），而手術后各組數據比較沒有顯著性差異（P＞0.05）。……