動態濁度法定量檢測茵梔黃注射液中細菌內毒素

江蘇省鹽城市藥品檢驗所（224002）王梅娟

茵梔黃注射液為茵陳提取物、梔子提取物、金銀花提取物及黃芩苷經加工制成的滅菌水溶液，具有清熱、解毒、利濕、退黃的功能，臨床應用于用于肝膽濕熱，面目萎黃，胸脅脹痛，惡心嘔吐，小便黃赤。急性、遷延性、慢性肝炎。臨床用藥廣泛，又常用于靜脈滴注，現標準為進行熱原檢查，且為中藥制劑，對它進行熱原控制有實際意義，因細菌內毒素限值檢查具有較大的干擾性，故選用動態濁度法測定其細菌內毒素可消除其干擾，結果準確可靠，且對茵梔黃注射液進行添加內毒素回收試驗及熱原檢查的對比試驗，以此建立分析方法，現報告如下：

1 材料與儀器

茵梔黃注射液（批號20080903、20081107、20090109、20090206，江蘇省長江藥業有限公司）；TAL 試劑（批號20080208，λ=0.03EU·ml-1，規格0.5ml·Amp-1,湛江海洋生物制品檢定廠）；細菌內毒素國家標準品（批號2008-3，70EU·Amp-1，中國藥品生物制品檢定所）；細菌內毒素檢查用水（批號20080208，規格10ml·Amp-1，湛江海洋生物制品檢定廠）；BET-32C 細菌內毒素測定儀（天津大學無線電廠）。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值的確定[1]公式為：L=K·M-1，K為規定的給藥途徑，即每人每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑為5 EU·kg-1；M為1h每公斤體重的最大給藥劑量為10ml·kg-1，計算得樣品的內毒素限值L為0.5EU·ml-1。

2.2 標準曲線制備及可靠性[1]細菌內毒素檢查用水將內毒素國家標準品進行10及2倍稀釋，最終細菌內毒素濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313 EU·ml-1稀釋系列；各取0.1ml分別加到預先加有0.1ml TAL試劑反應管內，混合均勻，立即插入BET-32C細菌內毒素測定儀內進行自動檢測，其中每一濃度重復3管。結果見附表1。回歸方程：lgT=3.029－0.3304lgC，其中，相關系數r=-0.9987；最低濃度λ1=0.0313 EU·ml-1，空白對照管在檢測時間外，故標準曲線成立。

2.3 干擾試驗

2.3.1 樣品稀釋倍數計算[1]公式為：MVD=L·C·λ1-1。L為茵梔黃注射液內毒素限值；C為1ml·ml-1；λ1為標準曲線的最低內毒素濃度0.0313 EU·ml-1；計算得茵梔黃注射液最大有效稀釋倍數MVD為16倍。

2.3.2 樣品溶液配制及干擾試驗 將復方丹參注射液用內毒素檢查用水依次稀釋為2、4、8、16倍溶液，記為Ai液；同時另取4管，進行同樣倍數稀釋，但在稀釋液中添加濃度為M（4λ1）的細菌內毒素標準溶液；作為樣品添加內毒素陽性對照管，記為Bi液；分別取上述各液0.1ml，加入預先加有0.1ml TAL試劑的反應管內，混勻立即插入BET-32C細菌內毒素測定儀內進行檢測，其中每一個濃度重復3管，計算回收率。回收率（%）=（Bi液內毒素值-Ai液內毒素值）×M-1×100%。結果見附表2。標準曲線：lgT=3.029-0.3304lgC，r=-0.9987。樣品的添加內毒素平均回收率均在50%～200%范圍內，符合中國藥典2000年版規定，表明樣品的4個濃度溶液對鱟試劑無干擾影響。

2.4 樣品溶液正式試驗 分別取4批茵梔黃注射液，用細菌內毒素檢查用水制成4倍稀釋液，記為Ai液；同時另取4管進行4倍稀釋，并在稀釋液中添加濃度為M（4λ1）的細菌內毒素標準溶液，記為Bi液；分別取上述各液0.1ml，加入0.1ml TAL試劑的反應管進行檢測，其中每一個濃度重復3管，計算回收率。結果見附表3。標準曲線：lgT=2.928-0.3027lgC，r=-0.9988，4批復方丹參注射液的回收率均在50%～200%范圍內，表明茵梔黃注射液在本實驗條件下對TAL試劑無干擾影響，因此日常檢驗選用4倍即可。同時進行4批供試品的家兔熱原檢查對比試驗，結果一致，均為陽性。

附表1 標準曲線的可靠性（n=3）

附表2 茵梔黃注射液的干擾試驗（n=3）

附表3 茵梔黃注射液正式干擾試驗（n=3）

3 討論

3.1 從茵梔黃注射液的干擾試驗結果發現：茵梔黃注射液用細菌內毒素動態濁度法檢測，由于內毒素回收率在50%～200%范圍內，表明不存在干擾因素影響，且4批茵梔黃注射液的內毒素含量均在規定限度0.5EU·ml-1以下。

3.2 用傳統的家兔法檢測細菌內毒素，由于操作復雜，影響因素多，對試驗結果影響很大。利用動態濁度法進行細菌內毒素定量檢測，具有操作簡便、結果準確、檢測靈敏度高等優點，尤其避免了由于家兔差異及人為主觀判斷所出現的假陽性或假陰性結果。經過對比試驗，樣品的細菌內毒素定量檢測結果與家兔熱原檢測結果一致，說明使用細菌內毒素動態濁度法測定復方丹參注射液的細菌內毒素是可行的，可用細菌內毒素定量檢查法代替家兔熱原檢查法。