一株苯乙烯生物降解菌的分離、鑒定及其特性研究

門 娟，張朝正，李 舫，孔大為

（1.天津市塘沽區環境保護監測站，天津 300450；2.天津市天人和環保技術研發中心，天津 300450；3.天津科技大學 生物工程學院，工業微生物教育部重點實驗室，天津300457）

苯乙烯為無色透明油狀液體，易燃，有毒，難溶于水，能溶于醇類及醚類，廣泛用于塑料、合成橡膠、樹脂等生產中，是一種有重要價值的化合物．在苯乙烯的生產、使用、運輸、貯藏過程中會有較大量苯乙烯進入大氣和水體，造成大氣和水的污染，同時對人體健康有害．全球研究者自20世紀70年代以來己從各地土壤、廢水中分離到有苯乙烯降解能力的多種微生物[1-2]，取得了一定的成果，其中Pseudomonas fluorescens ST[3]，Actinomycetes[4]，Rhodococcus pyridinovorans[5]，Brevibacillus sp.[6]，Pseudomonas sp.SR-5[7]，Pseudomonas putida SN1[8]等均研究報道效果明顯．也有研究者采用其它方法進行苯乙烯的降解研究[9-10]．

本文采用唯一碳源篩選的方法，從苯乙烯生產廠家處理污水的活性污泥中分離出一株高效苯乙烯降解菌，對其進行了分類鑒定，研究了該菌株在不同條件下的降解能力，考核了在實際污水中的降解效果．通過研究其特性，有助于了解其降解機理，以便改進含苯乙烯的工業廢水的處理，并利用微生物的凈化能力，在一定程度上解決環境污染問題．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 活性污泥

天津塘沽苯乙烯生產廠家處理污水的活性污泥，由塘沽區環保局環境保護監測站采樣．

1.1.2 主要試劑

酵母粉，蛋白胨，牛肉膏，NaCl，葡萄糖，瓊脂粉，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，硫酸銨，硫酸鎂，所有試劑均為生化試劑或者分析純試劑．

1.1.3 主要儀器

自動微生物鑒定系統，Biolog公司；PCR儀，電泳儀，電擊儀，核酸蛋白分析儀均為Bio-rad公司產品；氣相色譜，Agilent6890N．

1.1.4 培養基

唯一碳源培養基（液體）：硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉1.3g/L，硫酸鎂0.2g/L，pH7.0，121℃滅菌20 min．接種前加入配制好的一定量的苯乙烯瓊脂塊．

唯一碳源培養基（固體）：硫酸銨2 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，磷酸氫二鈉1.3 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH7.0，121℃滅菌20 min，倒平皿前加入1%體積的苯乙烯．

苯乙烯瓊脂塊：瓊脂20 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min，待冷卻到50~60℃時加入1%體積的苯乙烯，混勻后倒平皿（稍厚）．用刀切成小塊備用，放置時間不要超過1 h．

按照黨中央、國務院和云南省委、省政府關于生態文明建設和決戰脫貧攻堅的決策部署，緊密聯系林業現代化建設和改革發展實際，圍繞增綠、增質、增效和提供更多優質生態產品以滿足人民日益增長的優美生態環境需要的目標，云南省對林業供給側結構性改革和配套措施的探索，長期走在國內前列。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯乙烯降解菌株的分離

將一定量的活性污泥放入100mL無菌水中，輕微震蕩，然后放于30℃培養箱中活化30min，震蕩使菌體盡可能多的從污泥上洗脫下來．將一定量的從污泥上洗脫下來的菌液接種到唯一碳源培養基（液體）中，30℃培養2 d；培養液涂布在唯一碳源培養基（固體）上，30℃培養，挑取較大的單菌落進行鏡檢，同時接種到唯一碳源培養基（液體）中30℃培養2d，然后再涂布在唯一碳源培養基（固體）上．經反復篩選，最后篩選出一株以苯乙烯為唯一碳源生長且具有高效降解能力的菌株，保存在營養肉湯培養基中．

1.2.2 菌體生物量與苯乙烯含量的測定

菌體生物量用核酸蛋白分析儀測定，把取得的發酵液6000r/min離心，菌體用無菌水洗滌3次，用相同體積的無菌水稀釋，然后用核酸蛋白分析儀檢測菌懸液在600 nm下的吸光度值，表征菌體的生物量，測定時以水作為空白．

采用氣相色譜儀Agilent 6890N（帶頂空自動進樣器）對苯乙烯的濃度進行檢測．

頂空自動進樣器的條件：閥溫60℃，平衡時間20 min，進樣量1L，頂空瓶（20 mL）中樣品液體積10 mL．

1.3 菌株的鑒定

菌株的鑒定采取文獻 [11]上的方法．

2 結果與討論

2.1 苯乙烯降解菌株的分離

把活性污泥洗脫液接種到唯一碳源液體培養基中30℃培養2d，然后把培養液在固體培養基上涂布，再把固體平板上的單菌落接種到液體培養基中，通過反復4次接種涂布，最后分離得到一株以苯乙烯作為唯一碳源生長的菌株，該菌株對苯乙烯有很強的降解能力，命名為MJ001．

2.2 菌株的形態及生化特性

菌株MJ001在固體培養基上，菌株形態見圖1．個體形態為稍彎、兩端鈍圓的桿菌，大小0.5~0.7，有鞭毛，能運動．革蘭氏染色陰性，著色不明顯，兼性厭氧，最適生長溫度30℃，最適pH6.7~7.4，三糖鐵實驗K/K，氧化酶反應陽性．

圖1 菌株MJ001的形態Fig.1 The configuration of MJ001

2.3 菌株MJ001的16SrDNA序列分析

細菌的16SrDNA結構具有保守性，能反應出生物物種的親緣關系，為生物系統的進化提供線索，也是生物物種的特征核苷酸序列．目前，16S rDNA序列分析已經成為細菌系統分類研究中最有力也是最常用的工具．

以菌株的總DNA為模板，利用細菌16SrDNA通用引物進行擴增，得到長度為1436bp的DNA，測定其基因序列，將測序結果輸入Gen Bank，用Blast軟件與已知的16SrDNA序列進行比對，根據比對結果知道該菌株采用16SrDNA序列分析的方法鑒定為Pseudomonas sp.．菌株的16S rDNA序列見圖2．

圖2 MJ001的16S rDNA序列Fig.2 The16S rDNA sequence of MJ001

2.4 菌株的Biolog鑒定

根據MJ001的生理生化實驗結果（革蘭氏染色陰性，三糖鐵實驗K/K，氧化酶反應陽性）確定MJ001的培養類型為GN-ENT（革蘭氏陰性腸道菌），把MJ001接種到BUG+B培養基上，30℃培養16h后用棉簽把菌落沾起，分散到GN/GP-IF（細菌專用接種液）中，制備成均一的菌懸液，調整濁度到52%±3%（透光度），然后接種到 GN（革蘭氏陰性菌）鑒定板上，接種量150L，30℃培養．對MJ001在鑒定板上培養4~6 h和16~24 h的結果讀取了數據，鑒定結果顯示與Pseudomonas aeruginosa最接近．

圖3給出了Biolog鑒定16~24 h時，MJ001對鑒定板上不同碳源的代謝情況．Biolog GN鑒定板上A1孔是水，其它95孔中為不同種類的碳源，種類包括有機酸、氨基酸和糖類等．圖3顯示在16~24 h時，MJ001對96微孔板中的59種碳源利用明顯，20種利用微弱，而對其中的16種碳源根本不利用，這和伯杰氏細菌鑒定手冊上的報道十分接近．

2.5 不同苯乙烯濃度下菌體生長情況及菌株MJ001的降解效果

把菌株接種在含有不同濃度苯乙烯的唯一碳源培養基中培養，30℃培養，間隔2h取樣，用核酸蛋白分析儀檢測菌懸液在600nm下的吸光度值，比較不同苯乙烯濃度對菌株生長的影響．從接種6h開始，間隔4 h取樣，檢測苯乙烯的降解情況．圖4是不同苯乙烯濃度對菌體生長的影響圖，圖5是不同苯乙烯濃度對菌株MJ001的苯乙烯降解率的影響．

從圖4可以看出MJ001在苯乙烯濃度1~7 mg/L時均能生長，生長趨勢一致．與5~7 mg/L苯乙烯濃度相比，在1~4 mg/L時，MJ001的延遲期較短，到穩定期生物量較大．可見MJ001在苯乙烯濃度1~7 mg/L時均能生長良好，隨著苯乙烯濃度的增加菌體濃度增加，在4 mg/L時，菌體濃度最大，大于4 mg/L時，由于苯乙烯的毒性，菌體濃度開始下降，但是穩定期時間較長，這可能由于苯乙烯濃度大，能持續提供營養．

圖5可以看出在不同的苯乙烯濃度下菌株MJ001對苯乙烯的降解情況略有不同．降解30h后，苯乙烯濃度在1~4 mg/L時，菌株MJ001對苯乙烯的降解率隨著苯乙烯濃度的增加而增加，苯乙烯濃度在4 mg/L時達到96.3%，但總體來看降解率在93.2%~96.3%之間，差別不大．而當苯乙烯濃度增加到5 mg/L后，隨著苯乙烯濃度的增加，降解率開始下降，苯乙烯濃度7 mg/L時降解率降到82.7%，這與此時的菌體濃度低的結果是一致的，原因也是一致的．

2.6 溫度對菌株MJ001降解效果的影響

考查在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃5個溫度下菌株MJ001對苯乙烯的降解情況，苯乙烯濃度4 mg/L．培養24 h后，檢測苯乙烯降解情況，不同溫度下的降解效果見圖6．溫度在30℃時對苯乙烯的降解率最大，可達95.3%，溫度過高和過低都影響對苯乙烯的降解，這與30℃為該菌株的最適生長溫度有關．

2.7 溶氧對菌株MJ001降解效果的影響

研究不同搖床轉速對苯乙烯降解效果的影響，選取8個不同的轉速，其它條件相同，考核溶解氧對MJ001的降解效果的影響，結果見圖7．由圖7可見不同的搖床轉速對菌株MJ001的降解效果幾乎沒有影響，這與菌株兼性厭氧的特性一致．

圖3 MJ001的代謝指紋特征圖Fig.3 The metabolic characteristics of MJ001

圖4 MJ001在不同苯乙烯濃度下的生長曲線Fig.4 The growth curve of MJ001 under different styrene concentration

圖5 MJ001對不同濃度苯乙烯的降解率Fig.5 The degradation rate of styrene under different concentration

圖6 不同溫度下MJ001對苯乙烯的降解率Fig.6 The effect of degradation rate of styrene on temperature

2.8 菌株在廢水中的降解試驗

選取了5個低濃度的苯乙烯廢水，研究菌株MJ001對真實廢水的降解試驗，發現在8h之內能降解苯乙烯總量的77.6%~88.5%，16 h之后苯乙烯降解89.6%~90.1%，24 h后各種濃度的苯乙烯溶液幾乎均能得到充分降解，苯乙烯終濃度小于0.5 mg/L，降解效率達到94%~96.2%，見表1．

圖7 轉速對MJ001的降解效果的影響Fig.7 The effect of degradation rate to styrene on shaker speed

表1 廢水中的降解實驗Tab.1 The degradation of styrene in waste water

3 討論

微生物降解苯乙烯的報道國內外均有，本研究采用唯一碳源篩選的方法從處理含苯乙烯廢水的活性污泥中篩選得到一株苯乙烯降解菌，命名MJ001．采用分子生物學鑒定和Biolog快速鑒定兩種方法對其進行鑒定，結果為Pseudomonas aeruginosa．研究了菌株在不同苯乙烯濃度、溫度、溶氧條件下的降解效果，該菌株30℃時，在一定苯乙烯濃度下均能較好的降解苯乙烯，在實際含苯乙烯廢水中對苯乙烯的降解率可達94%以上，達到排放標準．本文研究表明MJ001用于生物降解苯乙烯是可行的．

[1]Niall D O'Leary，Kevin E O'Connor，Alan D W Dobson．Biochemistry,genetics and physiology of microbial styrene degradation[J]． FEMS Microbiology Reviews，2002，26：403-417．

[2]Braun-Lüllemann A，Majcherczyk A，Hüttermann A．Degradation of styrene by white-rot fungi[J]．Appl Microbiol Biotechnol，1997，47：150-155．

[3]Giuseppina Bestetti，Patrizia Di Gennaro，Andrea Colmegna，et al． Characterization of styrene catabolic pathway in Pseudomonas fluorescens ST[J]． International Biodeterioration&Biodegradation，2004，54：183-187．

[4]Pol A，Haren FJ Jvan，Camp HJM Op den ，et al．Styrene removal from waste gas with a bacterial biotrickling filter[J]．Biotechnology letters，1998，20（4）：407-410．

[5]Gyung Jung，Chang-Ho Park．Characteristics of styrene degradation by Rhodococcus pyridinovorans isolated from a biofilter[J]．Chemosphere，2005，61：451-456．

[6]Jae Woong Hwang，Cha Yong Choi，Sunghoon Park，etal．Biodegradation of gaseous styrene by Brevibacillus sp using a novel agitating biotrickling filter[J]．Biotechnol Lett，2008，30：1207-1212．

[7]Jang JH，Hirai M，Shoda M．Styrene degradation by Pseudomonas sp SR-5 in biofilters with organic and inoganic packing materials[J]．Appl Microbio Biotechnol，2004，65：349-355．

[8]Ju Hee Han，Mi So Park，Jong Wan Bae，et al．Production of（S）-styrene oxide using styrene oxide isomerase negative mutant of Pseudomonas putida SN1[J]．Enzyme and Microbial Technology，2006，39：1264-1269．

[9]吳玉萍，趙之駿，張建良，等．介質阻擋放電降解苯乙烯的研究 [J]．中國環境科學，2003，23（6）：653-656．

[10]Ostapczuk A，Chmierlewski A G，Honkonen V．Preliminary test in decomposition of styrene by electron beam treatment[J]．Radiation Phys and Chem，1999，56：369-371．

[11]張朝正，郭蘭珍．利用16Sr DNA序列分析和Biolog快速鑒定方法鑒定產脂肪酶菌株 [J]．河北工業大學學報，2009，38（5）：52-55．