姜黃素對小鼠紅細胞膜唾液酸和封閉度的影響

賈紹華,張舜堯,彭海生

姜黃素(Curcumin)是從姜科植物姜黃(curcuma longa L.)的根莖中提取的一種酚類色素,不溶于水,易溶于冰醋酸和堿性溶液[1].研究表明,姜黃素具有多方面的藥理活性,如抗氧化、利膽抗炎、抗凝、降血脂及抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤[2]等作用外,還具有提高免疫功能的作用[3-5].前期實驗研究表明,姜黃素能夠顯著地升高紅細胞黏附腫瘤細胞的花環(huán)率,提高紅細胞C3b受體花環(huán)促進率,降低其抑制率及提高紅細胞膜的流動性[6].本實驗繼續(xù)從紅細胞免疫出發(fā),通過其對紅細胞膜唾液酸水平和封閉度的影響的研究來進一步探討姜黃素抗腫瘤的作用機制.

1 實驗材料與儀器

1.1 主要藥品及試劑

姜黃素(純度≥99%,購自四川金郁金科技開發(fā)有限公司.以二甲亞砜(DMSO)作為溶劑,稀釋成0.1 mmol/L的溶液,等量分裝,-20℃保存[7]);5-Fu(上海旭東海普藥業(yè)有限公司);考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒;SA試劑盒(南京建成生物工程研究所);皂素(上?；瘜W試劑采購供應站);DPH(Sigma公司)等.

1.2 動物及瘤株

昆明種小鼠,雌雄各半,體重(20±2)g,由哈爾濱市漢方實驗鼠類養(yǎng)殖所提供,合格證號:00101006.瘤株:H22荷瘤小鼠,購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院.

1.3 主要儀器

RF-540熒光分光光度計(日本島津公司);紫外721分光光度計(山東高密分析儀器廠);水平高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠);低溫超速離心機(美國貝克曼公司).

2 實驗方法

2.1 動物分組、建立模型和給藥

小鼠按隨機數(shù)字表隨機分為5組,每組10只.給藥組分別為姜黃素高(200 mg/kg)、中(100mg/kg)、低(50mg/kg)劑量組,陽性對照組選用5-Fu組(30 mg/kg),模型對照組給予相同體積的生理鹽水.無菌條件下抽取生長狀態(tài)良好的H22荷瘤小鼠腹水,以生理鹽水(1∶4)稀釋后,使腫瘤細胞數(shù)為5.6×105個/mL.每只0.2m L接種于各組小鼠腹腔,接種24 h后.次日各組小鼠sc注射相應試劑.每天1次,連續(xù)給藥7 d,于次日處死.

2.2 紅細胞膜SA水平的測定

使用試劑盒對紅細胞膜蛋白定量并測定SA水平,用分光光度計于560 nm波長處,讀取各管吸光度(A)值.

2.3 紅細胞膜封閉度的測定

2.3.1 紅細胞影泡的制備

1)不封閉影泡的制備

給藥7 d后次日小鼠眼球取血,肝素抗凝,在水平高速離心機下3 000 r/min離心10min,以生理鹽水(1∶3)洗滌2次,1∶1懸浮在生理鹽水中,得到紅細胞懸液,按1∶30加入預冷的雙蒸水或5P 8.4的等滲磷酸緩沖液(PBS),4℃下溶血,過夜,制成紅細胞溶血液.4℃下以2 000 r/min離心40 min,棄上清液,用5P8.4PBS洗滌3次,最后懸浮在一定量PBS中,制成影泡懸浮液.

2)封閉影泡的制備

影泡懸浮液在37日℃下水浴1 h,可獲得封閉影泡.

2.3.2 NADH-細胞色素C氧化還原酶活性的測定

按Zamudio[8]法進行:取4個試管,分別為不加皂素空白管(A),不加皂素樣品管(B),加皂素空白管(C),加皂素樣品管(D).首先在A、B、C、D管中都加入0.6 m L封閉影泡,第2步加入5P8.4的PBS,A管2.4mL,B管2.2 mL,C管2.2mL,D管2.0mL;第3步A、B管不加試劑,C、D管加入0.1%皂素各0.2mL;第4步A、C管不加試劑,B、D管加入5mmol/L K3Fe(CN)6各0.1 mL放置10m in;第5步A、C管不加任何試劑,B、D管各加6mmol/LNADH 0.1mL,加完計時1min后,混勻,在波長420 nm處比色,以加入NADH為起點,記錄反應開始6min內(nèi)的吸光度值(每隔1 min記錄1次).上述反應在25℃進行.比色對照,除不加NADH溶液外其他操作同上.

2.3.3 紅細胞膜封閉度的計算方法:

封閉度=(加表面活性劑酶活力-不加表面活性劑酶活力)/加表面活性劑酶活力 ×100%

3 實驗結果

3.1 姜黃素對H22荷瘤小鼠紅細胞膜SA水平的影響

結果見表1.結果顯示,與對照組比較,姜黃素低、中、高劑量組均可顯著地提高H22小鼠紅細胞膜上SA水平(P＜0.05),且陽性對照組5-Fu也可提高SA水平.

表1 姜黃素對H 22荷瘤小鼠腫瘤細胞膜表面唾液酸含量的影響n=10)

表1 姜黃素對H 22荷瘤小鼠腫瘤細胞膜表面唾液酸含量的影響n=10)

注:與陰性對照組比較:*P＜0.05

組別 劑量/(mg?kg-1)SA/(mmol?L-1)封閉度/%對照組 —0.1854±0.0146 48.41±1.31 5-Fu組30 0.2263±0.0036*56.06±2.57*Cur組50 0.2029±0.0176*54.52±3.03*100 0.2253±0.0046*59.11±1.69*200 0.2355±0.0124*62.84±3.69*

3.2 姜黃素對H22荷瘤小鼠紅細胞膜封閉度的影響

結果見表1與對照組比較,姜黃素低、中、高劑量組均可顯著地提高H22小鼠紅細胞膜上唾液酸含量(P＜0.05),且陽性對照組5-Fu也具有相似的結果.

4 討 論

姜黃素具有抗腫瘤作用是其重要藥理活性之一,包括誘導腫瘤細胞凋亡、分化及增殖等作用,本身還具有免疫增強作用.M Churchill等研究[9]表明姜黃素可以通過提高實驗動物的CD4(+)T細胞和B細胞水平來提高動物的免疫活性.紅細胞為機體內(nèi)重要的血細胞,也是機體內(nèi)重要的免疫細胞,1981年Siegel[10]提出了紅細胞免疫系統(tǒng)(Red-cell immune system)的新概念,開辟了機體免疫系統(tǒng)的新領域.現(xiàn)已證實,紅細胞具有識別、黏附、殺傷抗原、清除免疫復合物,而且參與機體免疫調(diào)控,其本身還存在有完整的自我調(diào)控系統(tǒng),是完整機體免疫系統(tǒng)中的一個子系統(tǒng)[11].

唾液酸是細胞膜上糖蛋白和糖脂糖鏈末端的殘基,廣泛分布于哺乳動物細胞膜表面,為細胞負電荷的主要來源,亦為細胞膜受體的重要成分[12],參與細胞分化、癌細胞的轉(zhuǎn)移、細胞的識別、黏附和接觸抑制等生理過程,決定著細胞膜的重要特征.因此,細胞膜上唾液酸含量的改變將導致細胞內(nèi)一系列生物學變化.紅細胞免疫功能隨著腫瘤的發(fā)展呈下降趨勢,在腫瘤侵襲早期和中期下降最為迅速,而腫瘤轉(zhuǎn)移開始至腫瘤轉(zhuǎn)移晚期以后,其下降速度減慢,認為這一改變可作為評估腫瘤發(fā)展程度的參考指標之一.紅細胞膜表面亦含有唾液酸,腫瘤患者紅細胞膜表面SA的減少,促進紅細胞的老化,脆性增加,細胞易崩解破裂,影響紅細胞的正常生理功能.實驗結果顯示,姜黃素可以顯著地提高H22荷瘤小鼠唾液酸和封閉度水平,增強細胞膜活性而達到提高紅細胞免疫功能的目的.

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