人源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-C結(jié)構(gòu)域在畢赤酵母中的表達(dá)

趙鈺嵐，徐玨，許傳蓮

浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)與分子酶學(xué)研究室，杭州 310018

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

人源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-C結(jié)構(gòu)域在畢赤酵母中的表達(dá)

趙鈺嵐，徐玨，許傳蓮

浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)與分子酶學(xué)研究室，杭州 310018

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (ACE，EC3.4.15.1) 在調(diào)節(jié)血壓方面具有重要作用，研究證實(shí)，ACE-C結(jié)構(gòu)域是體內(nèi)使血管緊張素I (AngI) 分解的主要活性位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增ACE-C結(jié)構(gòu)域基因片段，克隆至分泌表達(dá)載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，陽性克隆再次電轉(zhuǎn)，用G418篩選高拷貝的酵母菌落進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化，獲得0.5 g/L的蛋白表達(dá)量及7.178 U/mL的酶活力。經(jīng)Ni+親和層析純化，獲得純度大于97%的目的蛋白。Captopril對(duì)酶的抑制試驗(yàn)證明ACE-C結(jié)構(gòu)域可望成為新一代抗高血壓藥物ACE抑制劑篩選的理想酶靶。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，催化結(jié)構(gòu)域，畢赤酵母，卡托普利

Abstract:Angiotensin I-converting enzyme (ACE, EC3.4.15.1) plays an important role in regulating blood pressure. The C-domain of ACE has been identified as the main catalytic site of angiotensin I cleavageinvivo. The ACE gene fragment of the C-domain was amplified by PCR and cloned into the pPIC9K secretory expression plasmid. The recombinant plasmid was transformed intoPichia pastorisstrain GS115. Positive clones were selected and subject to electroporation. Antibiotic G418 was used for the screening of multicopy inserts. After optimization of the expression system, the protein yield reached 0.5 g/L by flask-shaking culture fermentation, and enzyme activity reached 7.178 U/mL in the fermentation supernatant. The purity of the target protein obtained was 97% after Ni+affinity chromatography. Enzyme inhibitory activity assay using Captopril showed that it is promising to use ACE-C domain as new generation of target for screening ACE inhibitor antihypertensive drugs.

Keywords:angiotensin converting enzyme, catalytic domain,Pichia pastoris, Captopril

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (Angiotensin-converting enzyme，ACE) 是一種通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，參與血管緊張素II (Ang II)的生成和緩激肽 (BK) 的失活過程，對(duì)血壓調(diào)節(jié)，腎臟和心血管功能起關(guān)鍵作用的鋅離子依賴蛋白水解酶[1-5]。研究發(fā)現(xiàn)，ACE由兩個(gè)同源的活性結(jié)構(gòu)域 (C-結(jié)構(gòu)域和 N-結(jié)構(gòu)域) 組成，C-結(jié)構(gòu)域主要與 AngII 的生成相關(guān)，N-結(jié)構(gòu)域主要涉及出血調(diào)節(jié)[6-7]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，N-結(jié)構(gòu)域?qū)ρ獕旱恼{(diào)節(jié)沒有顯著影響，因此，ACE-C結(jié)構(gòu)域與全長序列ACE生成Ang II的能力幾乎相同[8]。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑 (ACEI) 是臨床主要降壓藥物。目前，ACEI的設(shè)計(jì)均以全長序列 ACE為靶蛋白，這種相對(duì)非選擇性的ACEI在抑制AngⅡ生成的同時(shí)也抑制了緩激肽的降解，易產(chǎn)生咳嗽、腎功能不全等副作用[9]?！?br>