新型重組AAV5/5載體及包裝系統

董小巖，田文洪，袁振華，譚淑萍，吳小兵

1 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 病毒基因工程國家重點實驗室，北京 100052

2 復旦大學 生命科學學院 遺傳學研究所 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200433

3 北京五加和分子醫學研究所有限公司，北京 100176

生物技術與方法

新型重組AAV5/5載體及包裝系統

董小巖1,2,3*，田文洪1*，袁振華1，譚淑萍1，吳小兵1

1 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 病毒基因工程國家重點實驗室，北京 100052

2 復旦大學 生命科學學院 遺傳學研究所 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200433

3 北京五加和分子醫學研究所有限公司，北京 100176

本研究組建了一種可用于規模化生產的以重組單純皰疹病毒為輔助病毒的AAV5/5載體包裝系統。首先，將5型腺相關病毒 (AAV5) 的rep和cap基因插入I型單純皰疹病毒 (HSV-1) 基因組非必需基因UL2中，獲得重組病毒rHSV1-rep5cap5。其次，構建一種攜帶AAV5 ITR的通用型載體質粒pAAV5neo，將報告基因EGFP插入pAAV5neo中，得到pAAV5neo-EGFP質粒。將pAAV5neo-EGFP質粒導入BHK-21細胞，用G418選擇培養，挑選出表達EGFP并在重組病毒rHSV1-rep5cap5感染下能高效產生rAAV5/5-EGFP的單克隆載體細胞株C020。用rHSV1-rep5cap5感染C020細胞制備rAAV5/5-EGFP，用“氯仿處理-聚乙二醇/氯化鈉-氯仿抽提”方法粗純化rAAV5/5-EGFP。用100 kDa分子量截流超濾方法進一步純化和濃縮，獲得高純度的rAAV5-EGFP。SDS-PAGE電泳分析可見3條特征性外殼蛋白帶。電鏡分析顯示病毒顆粒以實心顆粒為主。用rAAV5/5-EGFP病毒按1×105vg/cell感染體外培養的HEK293細胞，可見30%細胞呈現綠色熒光。本研究提出了一種高效AAV5/5載體生產系統和純化方法，為重組AAV5載體的進一步應用提供了基礎。

5型腺相關病……