超臨界CO2流體萃取莪術(shù)油的工藝研究

王 娟 劉漢清

1 鄭州市第二人民醫(yī)院藥劑科（450000）

2 南京中醫(yī)藥大學(xué)（210046）

莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis Val.、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C.F. Liang或溫郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling的干燥根莖。現(xiàn)代研究表明，莪術(shù)揮發(fā)油具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、抗氧化和保肝等活性，其抗腫瘤活性物質(zhì)主要為莪術(shù)醇（Curcumol）、欖香烯（Elemene）、牦牛兒酮（Germacrone，即吉馬酮）、莪術(shù)酮（Curzerenone）等[1]。超臨界CO2萃取（supercritical fluid extraction，SFE）技術(shù)是一項(xiàng)集提取、分離、濃縮為一體的新技術(shù)，其工藝優(yōu)越，質(zhì)量穩(wěn)定，能保持傳統(tǒng)中醫(yī)的用藥效果，適合工業(yè)化大生產(chǎn)的需要。故本試驗(yàn)采用GC、HPLC法測(cè)定莪術(shù)揮發(fā)油中主要抗癌活性成分莪術(shù)醇、牦牛兒酮的含量，并以次為指標(biāo)對(duì)莪術(shù)的CO2超臨界流體萃取工藝條件進(jìn)行了正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

莪術(shù)藥材（購(gòu)自南京市藥材公司，經(jīng)本校中藥鑒定教研室鑒定為）；莪術(shù)醇（中國(guó)生物鑒定所，批號(hào)：100185-200405）；牦牛兒酮標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111665-200801；CO2（純度99.9%，南京特種氣公司）；其他試劑皆為市售分析純。

1.2 儀器設(shè)備

氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫儀器公司，型號(hào)Agillent 4890；色譜柱：HP-35毛細(xì)管柱。

液相色譜儀：SPD-10Avp檢測(cè)器；島津LC-10ADvp泵；SDC-15恒溫柱溫箱；HW-2000色譜工作站；CT-21色譜信號(hào)采集單元。

超臨界流體萃取裝置（南通華安超臨界萃取有限公司，型號(hào)HA221-50-06）：萃取柱容積為1L，最高萃取壓力為50MPa，最高萃取溫度為75℃，最大流量為50L/h可調(diào)。設(shè)備的萃取流程為一級(jí)萃取，二級(jí)分離。萃取操作在設(shè)定萃取操作參數(shù)后，由程序控制萃取及分離操作的壓力和溫度。

分析天平FA1104：上海天平儀器廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 莪術(shù)醇含量測(cè)定方法建立[2-4]

2.1.1 色譜條件

Agilent 4890氣相色譜儀；HP-35毛細(xì)管柱；程序升溫：柱溫140℃，保持10min，以5℃/min升溫至170℃，保持1min，再以20℃/min升溫至200℃，保持1min；氣化室溫度250℃；FID檢測(cè)器溫度250℃；柱前壓10psi；載氣高純N2；進(jìn)樣量1μL。柱效以莪術(shù)醇計(jì)算，理論塔板數(shù)n=2000/m，分離度＞1.5。

2.1.2 莪術(shù)醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取莪術(shù)醇標(biāo)準(zhǔn)品加乙醚制成168.4μg/mL的溶液為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.1.3 莪術(shù)揮發(fā)油樣品溶液的制備

精密稱取各樣品約50mg至5mL容量瓶中，乙醚定溶至刻度，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)后，按2.1.1項(xiàng)下的GC色譜條件，1μL樣品進(jìn)樣，測(cè)定莪術(shù)醇含量，并計(jì)算莪術(shù)醇在莪術(shù)油中所占的百分比。

2.1.4 線性范圍的測(cè)定

從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中分別精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，乙醚定溶至1mL，配成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)液。每種濃度進(jìn)樣1μL，連續(xù)進(jìn)樣3次取峰面積的平均值，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，線性方程為：A=46.814C-582.26（r=0.9993）。結(jié)果表明：莪術(shù)醇質(zhì)量濃度在33.68～168.4μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，見(jiàn)表1。

2.2 牦牛兒酮的含量測(cè)定方法的建立[5]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：HederaODS-3（250×4.6mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；流速為0.8mL/min；流動(dòng)相：甲醇-水（85∶15）。

2.2.2 牦牛兒酮對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

表1 莪術(shù)醇線性范圍測(cè)定結(jié)果

表2 牦牛兒酮線性范圍測(cè)定結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

牦牛兒酮對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱定牦牛兒酮對(duì)照品加甲醇制成508μg/mL的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.2.3 莪術(shù)揮發(fā)油樣品溶液的制備

精密稱取各樣品約20mg至10mL容量瓶中，甲醇定溶至刻度，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)后，按2.2.1項(xiàng)下的HPLC色譜條件，10μL樣品進(jìn)樣，測(cè)定牦牛兒酮含量，并計(jì)算牦牛兒酮在莪術(shù)油中所占的百分比。

2.2.4 線性范圍測(cè)定

分別精密吸取牦牛兒酮對(duì)照品儲(chǔ)備液（508μg/mL）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，甲醇定溶至5mL。精密吸取上述各液10μL進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表2。以各樣的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，并對(duì)各點(diǎn)進(jìn)行回歸，得回歸方程為A=4480.8C+34673（r=0.9993）。結(jié)果表明：牦牛兒酮質(zhì)量濃度在50.8～304.8μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品含量測(cè)定[6-9]

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，藥材粉碎過(guò)20目篩，以萃取溫度、萃取壓力、提取時(shí)間、夾帶劑（95%乙醇）用量為實(shí)驗(yàn)因素[3]，取三水平，選用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表3。

按表3的實(shí)驗(yàn)條件提取莪術(shù)油，為減少誤差，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件水平做3次，計(jì)算平均出油率；提取出的莪術(shù)油分別按“2.1、2.2”項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣3次，取其各自的平均峰面積，代入線性回歸方程，計(jì)算莪術(shù)醇、牦牛兒酮在莪術(shù)油中所占的百分含量。

3 結(jié)果與討論

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以綜合加權(quán)評(píng)分的方法對(duì)莪術(shù)油的出油率、莪術(shù)醇含量、牦牛兒酮含量3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，綜合評(píng)分越高，說(shuō)明該提取工藝越好，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)公式1，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表5 方差數(shù)據(jù)分析

由表5可知，超臨界萃取莪術(shù)揮發(fā)油的影響因素中，夾帶劑濃度的影響較其他3項(xiàng)因素顯著，萃取壓力和萃取溫度次之，萃取時(shí)間的影響較小。由此得出超臨界萃取莪術(shù)揮發(fā)油的最佳工藝方案為A2B3C2D2，即萃取溫度45℃，萃取壓力25MPa，提取時(shí)間2h，夾帶劑用量10%。

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

取1kg粉碎的莪術(shù)藥材按最佳工藝條件A2B3C2D2進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)，以莪術(shù)油提取率為指標(biāo)進(jìn)行考察，結(jié)果藥材莪術(shù)油的提取率為3.8%。表明按最佳工藝提取，莪術(shù)油的提取量超過(guò)正交試驗(yàn)表中結(jié)果的較高值。說(shuō)明工藝合理，可行性較高。

3.4 討論

超臨界CO2流體萃取莪術(shù)醇的最佳工藝為萃取溫度45℃，萃取壓力25MPa，提取時(shí)間2h，夾帶劑（95%乙醇）用量10%，SFE法對(duì)莪術(shù)油及莪術(shù)醇的提取率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的水蒸氣蒸餾法的提取率。實(shí)驗(yàn)證明，超臨界流體萃取技術(shù)較傳統(tǒng)方法萃取能力強(qiáng)，萃取效率高，有利于提高產(chǎn)品收率和資源利用率。而且提取時(shí)間短、能耗低，還可避免使用大量機(jī)溶劑，減少污染，因此用超臨界流體萃取技術(shù)提取莪術(shù)醇具有開(kāi)發(fā)價(jià)值。

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