鹽巴戟天炮制工藝的優化

鄒 兵 馬雪松 佟連琨 姜永糧*

1 遼寧省鞍山市食品藥品檢驗所（114006）

2 遼寧中醫藥大學附屬醫院（110032）

3 遼寧中醫藥大學（116600）

巴戟天為茜草科植物巴戟天（Morinda officinalis How.）的干燥根，味甘辛，性微溫，有補腎陽、強筋骨、祛風濕之功效[1]。巴戟天始載于《神農本草經》，列為上品，歷代本草均有記載。是我國著名的“四大南藥”之一，用于陽痿遺精，宮冷不孕，月經不調，少腹冷痛，風濕痹痛，筋骨痿軟等癥。巴戟天中含有蒽醌、多糖、寡糖、脂類、有機酸等11類化合物及24種無機元素[2]。巴戟天的化學成分及其藥理作用已有部分研究[3,4]，陳小娟等[5]探討了巴戟多糖的免疫作用，認為其能增加幼年小鼠的胸腺的重量，提高小鼠巨噬細胞吞噬百分率和小鼠脾臟免疫特異玫瑰花結形成細胞的形成；巴戟天多糖可以提高果蠅性活力，并顯著提高果蠅新生幼蟲的羽化率，認為巴戟天多糖具有明顯的補腎壯陽作用[6]。巴戟天寡糖具有明顯的補腎壯陽作用，屬于巴戟天補腎壯陽作用的有效成分之一[7]。臨床上一般用鹽巴戟天，炮制后寡糖變化如何？尚無人考察，因此我們測定了巴戟天中補腎壯陽的主要成分耐斯糖和多糖的含量，并以此為指標確定了鹽巴戟天的炮制工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AB液相色譜儀；LC-Solution色譜數據工作站；電霧式檢測器（美國惠澤公司）；UV-3010紫外分光光度計；METTLER AE240型十萬分之一分析天平（瑞士METTLER）。

1.2 試藥

生品巴戟天藥材購自廣東德慶種植基地，經遼寧中醫藥大學中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為茜草科植物巴戟天（Morinda officinalis How.）的干燥根；鹽（市售）；耐斯糖對照品（購自sigma公司，純度＞98%）；D-無水葡萄糖對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110833-200503）。

2 方法與結果

2.1 耐斯糖含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

取耐斯糖對照品適量，精密稱定，置50mL量瓶中，加流動相，甲醇-水 （3∶97），制成每1mL含0.2148mg的溶液，即得。

2.1.2 鹽巴戟天樣品的制備

取凈巴戟天，加鹽水拌勻，置適宜的容器內，加熱蒸透或至規定的程度時，趁熱除去木心，切段，干燥[8]。

2.1.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相50mL，密塞，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用流動相補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液即得[9]。

2.1.4 測定條件

色譜柱：Diamonsil C18（5 μm，250mm×4.6mm）；流動相∶甲醇-水 （3∶97）；柱溫：30℃；流速：0.8mL/min；進樣量10 μL。

在上述色譜條件下，該分析條件良好，符合定量分析要求。耐斯糖對照品、生品巴戟天及鹽巴戟天HPLC色譜圖分別見圖1。

圖1 巴戟天HPLC圖

2.1.5 線性范圍考察

取耐斯糖對照品適量，精密稱定，置50mL量瓶中，加流動相，甲醇-水 （3∶97），制成每1mL含0.2148mg的溶液，即得。

精密吸取濃度為0.2148mg的耐斯糖對照品溶液10、20、30、40、50μL，進樣分析，測定色譜峰面積分別為830474、1536942、2163688、2832726、3462176。以耐斯糖對照品進樣量（μg）為橫坐標，耐斯糖色譜峰面積積分值為縱坐標，得耐斯糖線性回歸方程為：Y＝305363X-197445，相關系數r＝0.9998。表明耐斯糖的進樣量在2.148～10.740μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.6 精密度試驗

精密吸取上述配制的耐斯糖對照品溶液，連續進樣6次，每次20μL，按上述色譜條件，測定色譜峰面積，RSD為1.4%，測定結果表明，本實驗精密度符合有關規定。

2.1.7 穩定性試驗

按2.1.3，2.1.4項下制備供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液各10μL，分別在0時、4時、8時、12時、16時、24時，進樣分析，測定色譜峰面積，RSD為1.6%，實驗結果表明，供試品制備后24h內化學性質穩定。

2.1.8 重復性試驗

取巴戟天樣品粉末6份，按2.1.3、2.1.4項下制備供試品溶液，連續進樣6次，每次10μL，結果RSD為1.8%測定結果表明，本實驗重現性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗

取已知耐斯糖含量的鹽巴戟天樣品6份，每份約0.25g精密稱定，分別精密加入耐斯糖對照品適量，按2.1.3、2.1.4項下制成供試品溶液，測定結果表明，耐斯糖平均回收率為100.73%，RSD為1.3%。測定結果符合有關規定。

2.2 巴戟天中多糖的含量測定

2.2.1 巴戟天多糖的精制

稱巴戟天（三號篩）50g，加80%乙醇200mL浸漬24 h，85℃回流提取2次，每次1.5 h，過濾，藥渣加蒸餾水500mL浸泡1 h；90℃溫浸50min，抽濾，濾渣加120mL蒸餾水浸泡過夜，過濾，合并濾液；在電子萬用爐上加熱，濃縮至70mL，每30mL濃縮液加10mL氯仿萃取，萃出液呈棕色黏稠液；合并濃縮液約70mL加入0.75g活性炭脫色，加熱90℃抽濾，濾液濃縮至60mL，加95%乙醇250mL搖勻，靜置于冰箱；過濾，以95%乙醇多次洗滌，無水乙醇，乙醚，丙酮每次10mL 3次洗滌，60℃烘干，備用[10]。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密量取10.0mg D-無水葡萄糖于250mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，制成濃度為0.1mg/mL儲備液。

2.2.3 測定條件

按制備方法項下操作制備對照液、供試液和空白液，在400～800nm波長范圍內進行光譜掃描，均在484nm處均有最大吸收值，故選定484nm作為含量測定的最大波長。

2.2.4 標準曲線的繪制

精密量取葡萄糖標準液（100mg/L）0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL于25mL具塞比色管中，加蒸餾水至2.00mL，再各加5%苯酚溶液1.60mL搖勻，迅速加入濃H2S04溶液7.50mL，振搖5min，放置10min，置沸水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫；于484nm，以試劑空白為參比測定吸光度。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得回歸方程：Y=11.79X+0.0155，r=0.9997，結果表明，D-無水葡萄糖溶液濃度在0.005～0.06mg/mL的范圍內與與吸收值有良好的線性關系。

2.2.5 換算因子的測定

精密稱取已制備巴戟天多糖5.0mg，加蒸餾水溶解，轉移至25mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻制得巴戟天多糖儲備液；吸取多糖儲備液2.0mL，置于10mL容量瓶中，加水定容；吸取上述溶液2.0mL加5%苯酚溶液1.60mL搖勻，迅速加入濃H2S04溶液7.50mL，振搖5min，放置10min，置沸水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫；于484nm，以2.0mL水作空白對照，測定吸光度，由回歸方程求出此巴戟天多糖儲備液中葡萄糖的濃度，按如下公式求換算因子：f=m/（C×D×V），式中m為巴戟天多糖的質量（mg），C為巴戟天多糖儲備液中葡萄糖濃度（mg/L），D為巴戟天多糖的稀釋倍數，V為體積（mL）[10]（表1）。

表1 換算因子的測定

由表可得，換算因子平均值為1.2361，RSD=0.12%，表明精密度良好。

2.2.6 供試品溶液的制備

取鹽巴戟天樣品適量，粉碎，取過三號篩約0.2000g，于圓底燒瓶內，加150mL 80%的乙醇，于90℃水浴回流1h，過濾，濾渣中加150mL蒸餾水，90℃水浴1h，過濾，殘渣用熱水洗4次，每次10mL，合并濾液，轉入250mL容量瓶中，定容。吸取2mL用蒸餾水定容至10mL，即得供試品溶液。

2.2.7 樣品的測定

吸取供試品溶液2.0mL，按2.2.4項下的操作，依據回歸方程求供試品液的濃度，并且轉換成百分含量。多糖質量分數 W% = （C×D×f/m ）×100%，式中： C為葡萄糖的濃度，D為多糖稀釋因素，f為換算因子，m為樣品質量。

2.2.8 精密度試驗

取一定濃度的標準品溶液，按上述條件，連續6次測定吸光度，測定RSD 為1.0%，結果表明，本實驗精密度符合有關規定。

2.2.9 穩定性試驗

取供試品溶液2.0mL，按照2.2.4項下方法顯色后，室溫下放置，在上述光譜條件下于0、2、4、6、8、10、12h時間間隔，分別測定樣品吸光度，測定RSD為1.7%，實驗結果表明，供試品組分化學性質穩定。

2.2.10 重復性試驗

取巴戟天樣品粉末六份，按2.2.6項下制備供試品溶液，連續進行測定六次，計算總多糖含量，測定RSD為0.8%，結果表明本實驗重現性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗

取已知多糖含量的巴戟天樣品6份，每份約0.1g，分別加入D-無水葡萄糖對照品適量，按2.2.6、2.2.7項下操作，測定樣品吸光度，葡萄糖平均回收率為99.92%，RSD為1.3%，結果符合有關要求。

3 鹽巴戟天工藝優選

3.1 鹽巴戟天樣品的制備

取藥材每份50g，于煤氣爐上密閉按鹽蒸要求用蒸鍋蒸制。

3.2 樣品溶液的制備及測定

按2.1.3、2.2.6項下要求制備各供試品溶液。并分別于2.1.4、2.2.3及2.2.4項下條件測定耐斯糖及巴戟天中多糖的含量，進行分析。

3.3 單因素考察

3.3.1 鹽溶液用量考察

取生品巴戟天5份，每份50g，置密閉容器內，分別加入已配好的2%鹽溶液30、40、50、60、70mL，拌勻悶潤，待鹽水被吸盡后，蒸30min后出鍋，烘干，粉碎，過60目篩，備用。取各樣品，按上述供試品溶液的制備方法和色譜條件進行測定，結果見表2。

由表2可以看出在加鹽水量為每50g藥材用鹽水50mL時，指標性成分含量的綜合評分最高，因此選擇50mL鹽水為最佳，進行下一組單因素考察。

表2 溶液用量考察結果（n=3）

3.3.2 鹽用量考察

取5份生品，每份50g，置蒸鍋內，分別加入用不同鹽量配制的溶液50mL，悶潤，待鹽水吸盡后，蒸30min后出鍋，烘干，粉碎，過60目篩，備用。

取各炮制品粉末，按上述實驗方法中指標性成分含量測定項下的供試品溶液的制備方法和條件進行含量測定，結果見表3

表3 鹽用量（%）考察結果（n=3）

由表3可知，鹽用量是影響巴戟天指標性成分的因素，加鹽量2%的巴戟天炮制品為最佳，故選鹽量為2%進行下一組單因素考察。

3.3.3 悶潤時間考察

取5份生品，每份50g，置蒸鍋內，加入2%鹽溶液50mL，悶潤不同時間，待鹽水吸盡后，蒸30min后出鍋，烘干，粉碎，過60目篩，備用。

取各炮制品粉末，按上述實驗方法中指標性成分含量測定項下的供試品溶液的制備方法和條件進行含量測定，結果見表4。

表4 悶潤時間考察結果（n=3）

由表4可知，悶潤時間是影響巴戟天指標性成分的因素，悶潤4h為最佳，故選悶潤4h進行下一組單因素考察。

3.3.4 蒸制時間考察

取5份生品，每份50g，置蒸鍋內，加入2%鹽溶液50mL，悶潤4h，待鹽水被吸盡后，蒸制不同時間后出鍋，烘干，粉碎，過60目篩，備用。

取各樣品粉末，由上述實驗方法的制備方法和條件進行含量測定，結果見表5。

由表5可知，蒸制時間是影響巴戟天指標性成分的因素，結果為蒸制時間60min的巴戟天綜合評分最高。

4 正交實驗

由單因素實驗結果可知，鹽水用量、加鹽量、悶潤時間和蒸制時間均對巴戟天有效成分均有影響，故以加鹽量、悶潤時間和蒸制時間為考察因素，以耐斯糖和巴戟天中多糖的含量為指標，進行正交實驗，因素水平表見表6，正交試驗設計表見表7，方差分析表見表8。

表5 蒸制時間考察結果（n=3）

表6 因素水平表

表7 正交實驗設計表

表8 方差分析表

由正交實驗方差分析結果可知，鹽巴戟天的影響因素主次順序為：A ＞C＞B ，即加鹽量＞蒸制時間＞悶潤時間；且 A、C因素為顯著因素，即加鹽量和蒸制時間對耐斯糖和多糖的含量變化有顯著影響。而因素B 對耐斯糖和多糖的含量變化無顯著影響。所以，確定鹽巴戟天炮制工藝為A1B3C2，即50g藥材加入50mL 2%的鹽水拌勻悶潤5h，加熱蒸制60min，趁熱除去木心，切段，干燥。

5 驗證實驗

按優選的最佳炮制工藝制備3份樣品，按上述實驗制備方法和條件進行含量測定，結果見表9。由表9可見，樣品1、2和3的耐斯糖和多糖含量均較高，與正交試驗結果相符，說明鹽巴戟天炮制工藝穩定可行。

表9 驗證實驗結果

6 討論與結論

6.1 2005年版中國藥典收載的巴戟天炮制品為巴戟天、巴戟肉、鹽巴戟天和甘草制巴戟天4種[8]，且以巴戟肉、鹽巴戟天和甘草制巴戟天為主流飲片規格[11]。巴戟天的炮制特點是借助所用輔料固有的作用，以增強其壯陽、補益功能，并獲得滿意療效，用鹽取其下行入腎，增強補腎助陽、強筋健骨的作用[12]。鹽制巴戟功專入腎，溫而不燥，增強了補腎壯陽、強筋健骨作用[11]。

6.2 巴戟天低聚糖類物質具有顯著的抗抑郁活性和補腎助陽的作用，但由于糖類檢測的局限性，對這類成分炮制后變化的分析一直未見報道。本文采用新型的通用型檢測器-電霧式檢測器（CAD），用HPLC法分析巴戟天中低聚糖耐斯糖，結果表明巴戟天中耐斯糖炮制后含量增加，這和文獻資料記載鹽制品增強補腎陽功能較為吻合。

6.3 巴戟天中多糖為活性成分，所含的多糖有增強免疫和補腎助陽的作用，炮制過程有利于多糖的溶出，起到增效作用，但蒸制時間過長多糖會散失，故蒸制時間應嚴格控制。本實驗用一定濃度的食鹽水悶潤巴戟天至一定時間后蒸制，工藝簡便、易于操作、工藝參數可控，并能保證炮制品的質量。蒸制時間對多糖有較顯著的影響，生品經蒸制多糖含量升高，至30min達到最高，但隨時間延長，多糖含量則呈下降趨勢，60min后下降明顯，說明巴戟天的蒸制時間應控制在60min內，以保證有效成分的含量。

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